UPLC-MS/MS 法同时快速测定保健食品中8种非法添加药物

UPLC-MS/MS 法同时快速测定保健食品中8种非法添加药物

穆台力甫·卡乌力（第一作者）尼亚孜·乌吉艾合买提（第二作者）阿依努尔·阿木提（第三作者）阿迪力江·谢日普（第四作者）

（喀什地区食品药品检验所  844000）

摘要：目的：建立同时快速测定保健食品中罗格列酮，苯乙双胍，二甲双胍，麻黄碱，阿替洛尔，酚酞，N-单去甲基西布曲明，N,N-双去甲基西布曲明等 8 种非法添加药物的超高效液相色谱 - 串联质谱检测方法。方法：试样前处理采用甲醇为提取溶剂，经超声处理，Waters ACQUITY UPLC®BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱分离，以A为0.1%甲酸-10 mmol/L乙酸铵，B为乙腈为流动相梯度洗脱，流速0.3  mL·min-1，柱温为35℃，进样量  2  μL。质谱采用电喷雾离子源，以正离子多反应监测模式进行定性和定量分析。结果：8 种非法添加药物在本方法色谱和质谱条件下  9.1min  内能得到快速分离，在3 ～ 200ng·mL-1 线性关系良好，相关系数 R 为0.9990 ～ 0.9996，检出限为0.35~3.3 mg·kg-1。结论：本方法前处理过程简单快速，选择性强，灵敏度高，能够快速、准确地同时对保健食品中非法添加的格列酮，苯乙 双胍，二甲双胍，麻黄碱，阿替洛尔，酚酞，N-单去甲基西布曲明，N,N-双去甲基西布曲明进行定性及定量 测定。

关键词：超高效液相色谱 - 串联质谱法（UPLC-MS/MS）；保健食品；非法添加

Simultaneous and Rapid Determination of 8 Kinds of Drugs Illegally Added in Health Food by HPLC-MS/MS

MUTALLIP KAWUL

(Kashgar District Food and Drug Inspection Institute)

Abstract: Objective: To establish an UPLC-MS/MS method for simultaneous determination of Rosiglitazone, Phenformin , Metformin, Ephedrine, Atenolol, Phenolphthalein,，N-Monodesmethyl Sibutramine and N,N-Didesmethyl Sibutramine  in health food. Method: Samples was extracted with Methanol and handled by ultrasound, used Waters ACQUITY UPLC®BEH column C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm) with mobile phase of A (0.1% formic acid-10 mmol/L ammonium acetate) and  B is acetonitrile  by gradient elution ; the flow rate was 0.3 mL·min-1, the column temperature was 35 ℃ , and the sample volume was 2 μL. ESI (electro spray ion source) was used for mass spectrometry, and positive ion multiple reaction monitoring mode was used for qualitative and quantitative analysis. Result: Eight illegally added drugs can be separated rapidly in 9.1 minutes under the conditions of this method, each component has a good linear relationship within the range of 3～ 2500 ng·mL-1,The correlation coefficient  R was between 0.9990 and 0.9996, the detection limit was 0.35~3.3 mg·kg-1. Conclusion: The pretreatment process of this method is simple and rapid, high selectivity, high sensitivity, it can be used as a rapid and simultaneous determination method for the illegally addition of Rosiglitazone, Phenformin , Metformin, Ephedrine, Atenolol, Phenolphthalein,，N-Monodesmethyl Sibutramine and N,N-Didesmethyl Sibutramine in health food.

Keywords: ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS); health food; illegally added

近年来，随着生活水平的提高，消费者对保健食品的需求也越来越强烈，其中补肾壮阳、降糖、减肥等热门功效的保健食品尤其受到消费者的追捧， 虽然目前与保健食品相关的法律法规越来越完善，保健食品行业日常监管也日趋规范，但由于保健食品行业有着高热度、高需求、高利润等特点，在高额利益的驱使和诱惑下，保健食品中非法添加药物的现象屡禁不止，如西地那非、他达拉非、西布曲明这些常见药物在日常监管中时有检出,相关检验方法的完善和研究工作也在进行并不断地在更新[1-6]。为了逃避监管，甚至会添加一些并不常见的药物成分或者同时添加多种不同功效的药物，隐蔽性越来越高，严重危害广大消费者的身心健康，因此本文除了以上常见的非法添加药物之外，补充和进一步完善了8种新型药物的检测方法，扩大了保健食品中非法添加物质的检测范围，增加保健食品中非法添加物质的检测项目，提高检测效率，为监管部门整治行业乱象提供更多的技术支持。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 实验试剂与对照品

乙酸铵：色谱纯，lot:C11805664，麦克林上海公司，规格250g；乙腈：色谱纯，lot:205309,thermo scientific，规格4L； 水为超纯水（由超纯水器制备）；马来酸罗格列酮对照品（批号： 100952-201902,99.6%，中国食品药品检定研究院）；盐酸苯乙双胍对照品（批号：100922-201001,99.7%，中国食品药品检定研究院）；盐酸二甲双胍对照品（批：100664-202106,100%，中国食品药品检定研究院）；盐酸麻黄碱对照品（批号：1712 41-201809,100%，中国食品药品检定研究院）；阿替洛尔对照品（批号：100117-201606，99.7%，中国食品药品检定研究院）；酚酞对照品（批号：100091-201802,99.8%，中国食品药品检 定研究院）；盐酸N-单去甲基西布曲明对照品（批号：520002-201902,97.7%，中国食品药品检定研究院）；盐酸N,N-双去甲基西布曲对照品（批号：520001-201902,94.4%，中国食品药品检定研究）；固体供试品，西洋参苦瓜铬胶囊。

1.1.2 仪器

TSQ Quantunm ACCESS MAX 液相色谱/质谱连用仪 美国赛默飞世尔；GTR320A高速台式冷冻离心机 河南可成仪器设备有限公司；Direct 8/16 纯水/超纯水一体机系统 Milli-QIntegral。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC®BEH C18.（100mm× 2.1 mm，1.7 μm）；流速：0.3mL·min-1；进样量：2 μL；柱温：35 ℃；流动相：A为0.1%甲酸-10mmol/L乙酸铵，B 为乙腈，采用梯度洗脱，见表1。

表1 梯度洗脱

1.2.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源，正离子扫描；检测方式：多反应检测（MRM）；雾化温度：350℃；离子传输管温度：350℃；毛细管电压3500V；鞘气：35（Arb）；辅助气：10（Arb）；8 种分析物的详细质谱参数见表 2。

1.2.3 混合对照品标准曲线的制备及测定

分别精密称取10mg罗格列酮，苯乙双胍，二甲双胍，麻黄碱，阿替洛尔，酚酞，N-单去甲基西布曲明，N,N-双去甲基西布曲明对照品分别置50容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成浓度为200 μg·mL-1 的储备对照品溶液：精密移取储备对照品溶液各0.5 mL 分别置于 100 mL 容量瓶中，用初始流动相定容至刻度，摇匀，配制成浓度为1000 ng·mL-1中间溶液：精密移取储备对照品溶液各5 mL 同一置于 100 mL 容量瓶中，用初始流动相定容至刻度，摇匀，配制成浓度为10000 ng·mL-1混合对照品溶液： 精密量取混合对照品溶液0.02ml,0.06ml,0.15ml,0.25ml,0.5ml,075ml ,1.0ml，分别置50ml容量瓶中，用初始流动相定容，即得浓度为4 ng·mL-1、12 ng·mL-1、30 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、150 ng·mL-1 和 200 ng·mL-1 系列标准溶液，按上述检测条件进行测定，以对照品溶液的浓度为横坐标，定量离子的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

表2 各分析物的质谱参数

1.2.4 供试品溶液的制备与测定

精密称取样品1 g（固体样品研细，精确至0.000 1 g），置于50 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声提取15 min，放冷至室温，用甲醇定容，5000 r/min离心5 min，上清液经微孔滤膜过滤(0.22 µm，有机相)，取续滤液作为待测液。

不少保健食品中非法添加的药物含量较高，为避免过高浓度的分析物组分污染质谱系统，检测过程中应当先稀释较大倍数溶液进样，然后根据实际检测结果调整至合适的稀释倍数再进行测定。

2 结果与分析

2.1 专属性试验

分别取浓度为 100 ng·mL-1 的混合对照品溶液和加标供试品溶液（浓度为 100 ng·mL-1），按 1.2 的条件测定，记录 8 种分析物的定量离子提取离子流色谱图见图1、图2。结果显示加标供试品溶液中8 种组分的保留时间与混合对照品溶液一致，各组分分离效果和专属性良好。

2.2 方法的线性范围和检出限

称取1g样品置50ml容量瓶中，分别量取罗格列酮，苯乙双胍，二甲双胍，麻黄碱，阿替洛尔，酚酞，N-单去甲基西布曲明，N,N-双去甲基西布曲明标准品中间溶液(1000ng/ml) 0.395ml, 0.827ml,0.614ml,3.382ml,0.358ml,0.424ml，0.913ml,0.344ml，加到50ml样品瓶中，用初始流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，以信噪比为 3 的溶液浓度计算各分析物的方法检出限，实验结果表明，8种化合物在3 ～ 200 ng·mL-1 线性关系良好，本方法可满足其检测分析的需求。各分析物的线性和检出限结果见表3。

图1 混合标准溶液提取离子流色谱图

图2 加标供试品提取离子流色谱图

表3 各分析物的线性方程及检出限

2.3 加样回收率试验

分别称取9份1g样品置9个50ml容量瓶中，每三份一组分成低，中，高三个浓度，分别量取罗格列酮，苯乙双胍，二甲双胍，麻黄碱，阿替洛尔，酚酞，N-单去甲基西布曲明，N,N-双去甲基西布曲明混合对照品溶液(10000ng/ml) 0.05 ml, 0.25ml,0.5 ml 加到50ml样品瓶中，用初始流动相溶解并稀释至刻度，摇匀 ，按上述 1.2.4 方法步骤处理，制备成添加量为 0.5 mg·kg-1 ， 2.5 mg·kg-1 ， 5 mg·kg-1 的添加回收试样溶液，测定结果计算平均回收率，结果见图4。

表4 加标回收率和RSD(%)

由图4 可知罗格列酮，苯乙双胍，二甲双胍，麻黄碱，阿替洛尔，酚酞，N-单去甲基西布曲明，N,N-双去甲基西布曲明按本方法测定样品中的平均回收率结果为66.3% ～ 117.0%，准确性和稳定性较好。

2.4 重复性试验

取浓度为 100 ng·mL-1 的混合对照品溶液，按 1.2 的条件连续进样六针，记录 8 种分析物的定量离子提取离子流色谱图，8 种分析物的 六针进样峰面积RSD 分别为 1.1% ～ 3.6% ，表明本方法在固体样品的检测中具有良好的重复性，具体结果见表 4。

表 4 各分析物的精密度

3结论

本法采用甲醇为提取溶剂，高效液相色谱 - 串联质谱法测定，建立了能够同时快速测定保健食品中罗格列酮，苯乙双胍，二甲双胍，麻黄碱，阿替洛尔，酚酞，N-单去甲基西布曲明，N,N-双去甲基西布曲明等 8 种非法添加药物的测定方法，对方法的线性范围、试样加标回收率、精密度和检出限等进行验证和评价，方法操作简便、分离效能高、专属性强、结果准确可靠，显著缩短了分析时间， 能够满足实验室同时对上述 8 种不同功效的保健食品非法添加药物的快速测定工作，也为市场监管部门对保健食品非法添加药物监督管理的快速响应提供有力的技术支持。

参考文献：

[1]万远航 , 李静 .UPLC-MS/MS 法快速检测保健食品中非法添加西地那非等化学药物成分 [J]. 中国检验检测 ,2021,29(3):16-18.

[2]韩瑨烜 , 寇雷 , 李勇 , 等 .UPLC/MSMS 快速筛查减肥类保健食品中 6 种违禁药物 [J]. 食品工业 ,2022,43(7):303-306.

[3] 朱捷 , 何微 , 马桂娟 .HPLC-MS/MS 法同时测定补肾壮阳类保健食品中非法添加 11 种化药成分 [J]. 当代化工 ,2015,44(11):2729-2732.

[4]吴芳海，许琨琨，卢文斌，王晓峰，蔡振世等.UPLC-MS/MS 法同时快速测定保健食品中7 种非法添加药物;

[5]丁宝月 , 屠婕红 , 薛磊冰 , 等 .UPLC-MS/MS 法快速测定降压类中成药及保健食品中非法添加 34 种化学药的研究 [J]. 中草药 ,2015,46(5):688-696.

[6] 《保健食品中75种非法添加化学物的检测》（BJS 201710）;

作者简介：穆台力甫·卡乌力（第一作者）（1986—），男，新疆喀什人，本科毕业，主管药师。研究方向：食品药品检测分析

尼亚孜·乌吉艾合买提（第二作者）（1986—），男，新疆喀什人，本科毕业，实验师。研究方向：食品药品检测分析

阿依努尔·阿木提（第三作者）（1974—），男，新疆喀什人，本科毕业，高级实验师。研究方向：食品药品检测分析

阿迪力江·谢日普（第四作者）（1994—），男，新疆喀什人，本科毕业，助理实验师。研究方向：食品药品检测分析