荧光免疫分析仪检测灵敏度提升技术研究

荧光免疫分析仪检测灵敏度提升技术研究

罗毅

530381198712101219      重庆新赛亚生物科技有限公司

摘要：免疫分析技术创立以来在医学、生物学和环境学研究中占据着非常重要的地位。其中荧光免疫分析技术是利用荧光技术的高度敏感性与免疫学技术的高度特异性相结合，为免疫学、临床组织化学和实验室诊断提供了一项其他方法不能取代的检测技术。荧光免疫分析技术灵敏、准确、兼容性强。

关键词：荧光免疫；分析仪检测；提升技术

引言

目前，已上市的荧光分析仪器多为单通道设备，无法实现单样本多项目的同时检测，效率低、速度慢，当样本量较大时，难满足检测需求。且现有多通道荧光分析仪多采用转盘式结构，其结构复杂，可靠性差，测量结果准确性和稳定性较差。由于转盘式结构固有的缺陷，易造成进卡失败，分析仪因卡顿而死机，试剂卡翻转、卡死，转盘转动时，试剂卡易偏移，影响测量的重复性;试剂卡和光源相对运动，造成测量结果的准确性和稳定性较差等。

1概述

免疫层析技术是利用毛细作用使待测样本在试纸上迁移，当其与检测线处的抗原/抗体发生抗原－抗体特异性结合时，就可以判断该样本中含有目标抗体/抗原。荧光免疫层析技术基于此原理，将已知抗原或抗体标记荧光物质后与待测样本进行免疫反应，通过测定结合产物的荧光强度，从而得出待测物质的浓度。由于该抗原抗体反应具有特异性，并且已经面市多种免疫荧光分析仪及与其配套的检测试剂卡，操作简便，因此荧光免疫分析已经广泛用于临床的即时检验(point－of－caretesting，POCT)。在急救中心，该设备常用于出现胸痛、胸闷、呼吸困难等症状病人救治的辅助诊断。荧光免疫分析仪的工作原理是通过扫描检测试剂卡上的标记物和待测物结合区，进行荧光激发后接受荧光信号，从而将试剂卡中的色谱信号转为电信号，再进行分析拟合确定标本中特定物质的浓度。荧光免疫分析仪一般由主机(包括光电检测模块、扫描模块、数据处理模块、液晶显示模块、外壳等)、信息采集模块(如:二维条码扫描器、IC芯片读取器等)、电源、随机软件等部分组成，全自动仪器还包括加样模块、反应模块、温育温控模块、清洗模块等。

2荧光免疫层析的测定模式

荧光免疫层析测定的本质是抗原抗体的免疫结合反应，抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间的特异性结合反应，这种特异性结合取决于抗原表位和抗体超变区分子间的结构互补性与亲和性。抗原抗体之间的结合力主要包括四种：静电引力：即库伦力，是抗原抗体分子之间带相反电荷的基团之间的相互吸引力；范德华力：是原子与原子、分子与分子之间相互接近时原子（或分子）极化作用产生的吸引力；氢键结合力：是指供氢体上的氢原子与受氢体上的原子间的吸引力；疏水作用力：是在水溶液中抗原抗体分子中所包含的疏水基团与水分子接触，由于对水分子存在排斥力而产生的向内聚合趋向的力。抗原抗体之间的结合力的大小，从抗原抗体本身角度来看，主要受到抗原抗体之间的亲和力和亲合力决定。亲和力是指抗体分子单一抗原结合部位与抗原分子表面对应抗原表位（又称决定簇）之间的结合强度，亲和力用平衡常数K表示，K值越大，结合越牢固。亲合力是指一个抗体分子与抗原分子表面数个相应抗原表位（又称决定簇）之间的结合强度，只有一个结合表位的称为单价抗体，二价抗体亲合力为单价的1000倍，五至十价抗体亲合力是单价的107倍。抗原抗体的结合过程也即免疫反应的过程，常见的荧光免疫反应分为夹心法和竞争法，夹心法包括双抗原夹心法和双抗体夹心法。竞争法的反应原理是样本中的待测抗原与T线处同种抗原竞争性地与标记抗体相结合的过程。竞争法一般用于抗原分子较小或抗原分子缺乏可做夹心法的两个以上位点。竞争法又分为两种情况，第一种是样本中所含抗原与结合垫上的荧光修饰抗体不发生反应，当包含抗原和荧光修饰的抗体移动到检测线时，抗原和荧光修饰抗体分别与检测线上的捕获抗体结合，当样本中抗原与捕获抗体结合后荧光修饰的抗体则没有相应的结合位点，从而检测线上的荧光值会相应变弱，且与抗原浓度相关。修饰抗体竞争结合控制线上的抗原，游离的荧光修饰抗体越过检测线与后面的免疫蛋白结合形成控制线）第二种是样本中的抗原与结合垫上的荧光修饰抗体互相结合，荧光修饰的抗体抢占了抗原表面的结合位点，因此当混合物移动到检测线时，已经行成的抗原抗体复合物不能够再次与捕获抗体结合。夹心法也分为两种情况，第一种是待测物中的抗原与结合垫上的荧光修饰抗体结合后，再与检测线上的捕获抗体结合，形成双抗体夹心免疫复合物，检测线上的荧光强度与浓度呈正比关系，游离的荧光修饰抗体在到达控制线时，与控制线上的免疫蛋白结合。第二种是待测是抗体，且抗体表面有两个或两个以上结合位点时，待测抗体与结合垫上荧光修饰的抗原结合，与检测线上的捕获抗原形成双抗原夹心免疫复合物，这种检验方法属于间接测量法，是测量人体中已经产生的特异性抗体，间接的检验是否患有某种疾病，现常用于乙肝病毒和HIV病毒检验。

3临床评价

干式荧光免疫分析仪属于《免于进行临床试验的医疗器械目录（修订）》（国家药品监督管理局通告2018年第94号）（简称《目录》）的范畴，根据《医疗器械临床评价技术指导原则》的要求，可选择免临床路径进行评价。提交与《目录》描述一致，且与《目录》中已获准境内注册的等同产品的对比说明[6-7]。免临床途径重点关注申报产品和所选对比产品的等同性和差异性。（1）适用范围：关注检测结果输出形式为定性、定量或半定量，如定性分析仪不能覆盖定量的，反之亦然；还应关注两者可检测的临床项目是否基本相同。（2）结构组成：关注光学检测模块、机械单元、控制单元是否等同，是否具有自动加样、温育温控模块；若为全自动分析仪，还应关注液路单元是否等同；建议以申报产品和对比产品实物图和示意图的详细对比图片综合进行评价分析。（3）工作原理：关注工作原理是否等同，如发射光源、采集光波收集板属性是否相同。（4）性能指标：申报产品的性能指标原则上不低于对比产品，重点关注准确性、线性、重复性、稳定性等性能指标，并提交对比产品性能指标参数的来源依据。上述内容中，若申报产品和对比产品具有差异性，应明确该差异是否影响产品的安全性、有效性。若中国境内无注册申报产品的等同产品，应参照《医疗器械临床评价技术指导原则》的要求，通过同品种医疗器械临床试验或数据进行分析评价，或者通过临床试验进行评价。

结语

荧光免疫层析分析仪操作简便，能自动完成样本的定量检测、数据处理及结果输出，适用于医院急诊科、急救中心、社区医院等进行即时检测，其准确性和稳定性对于病情的诊断至关重要。仪器装机使用时，会根据现有的规范进行性能验证，但同时也需要选择合适的校准指标和校准方法评价仪器的计量性能，目前尚未有相关计量规范对设备进行周期性计量，使用者可依据行业规范检测各项指标是否能符合仪器的设计计量性能及试剂检测工作的需求，从而保证病人样本检验结果的真实可靠。

参考文献

[1]华川，府伟灵.免疫层析纳米金试纸研究方法进展[J].国际检验医学杂志，2020，34(17):2286～2289.

[2]赵红梅，孙青松，孙虹.即时检验在急性心肌梗死患者中的应用研究[J].临床急诊杂志，2020，17(04):308～309.

[3]贺巧丽.快速床旁检测(POCT)在急诊抢救中的优势[J].世界最新医学信息文摘，2021，17(84):244.