高糖诱导下心肌细胞炎症因子及p38MAPK信号传导通路的改变

高糖诱导下心肌细胞炎症因子及p38MAPK信号传导通路的改变

林小亮  高日扬 杨霞 

（海南省海口市第四人民医院心血管内科，海南海口 570000）

基金项目：海南省自然科学基金项目 项目编号：821MS0850

[摘要]目的：观察高糖诱导后心肌细胞炎症因子、p38MAPK和NF-κB的激活情况，从炎症角度探讨糖尿病心肌病的发生发展机制。方法：将H9C2小鼠心肌细胞分为2组，分别为：正常对照组、高糖诱导组。两组细胞建模培养后分别进行免疫荧光实验计算单个细胞面积及相同面积下细胞数，Western blot法检测心肌细胞NF-κB p65蛋白、p38MAPK 蛋白、IL-6和TNF-α的表达。结果：1、α-actinin免疫荧光染色可见高糖诱导组较正常对照组心肌细胞明显肥大，细胞表面积增大，相同视野里心肌细胞个数明显减少，心肌细胞α-actinin成有规则的条索状排列，表明高糖诱导组心肌肥大细胞模型诱导成功；2、与正常对照组比较，高糖诱导组心肌细胞p38MAPK蛋白、NF-κB p65 蛋白、IL-6及TNF-α的浓度水平均显著上升（P<0.05）。结论：高糖可能通过p38MAPK/NF-κB信号传导通路促进了心肌细胞的炎症反应，从而参与DCM的发生发展。

[关键词] 高糖；心肌细胞；炎症因子；p38MAPK

糖尿病心肌病（DCM）是糖尿病（DM）的一种慢性并发症，其早期主要的临床表现是左心室舒张功能障碍[1] ，后期可出现收缩功能受损，最后逐渐发展为充血性心力衰竭。糖尿病心肌病是导致糖尿病晚期死亡的重要原因之一[2]。尽管这一领域的研究正在深入开展，但是其确切发病机制还不是很清楚。有研究表明，炎症反应可能参与了糖尿病心肌病的发病[3]，p38MAPK信号的激活可能在糖尿病诱导的心脏炎症反应和后续的功能失调过程中起着重要作用。本研究通过观察高糖诱导后心肌细胞炎症因子、p38MAPK和NF-κB的激活情况，从炎症角度探讨糖尿病心肌病的发生发展机制。

1.实验方法

1.1 细胞培养和实验分组

将20只雄性 10 周龄雄性小鼠（海南省药物研究所提供，动物质量合格证号：46002100000825）分为2组，每组10只，分别为：①正常对照组：使用5.5 mmol/L 的葡萄糖 DMEM培养基作为对照组进行培养；②高糖诱导对照组：使用30 mmol/L 的葡萄糖 DMEM 培养基作为高糖组进行培养。各组细胞均继续培养48 h后收集细胞及培养基上清进行指标测定。所有细胞均培养于含NaHCO3 1.5g/L的DMEM培养基(GIBCO，货号12800017)，平均3d进行一次传代培养。

1.2 免疫荧光实验

收集培养后的心肌细胞，4%多聚甲醛固定，清洗后用0.5% TritonX-100处理细胞，加入2 mL封闭液，室温封闭1 h。滴加alpha-actinin一抗，室温孵育1 h，清洗完毕后加入相应荧光二抗。37℃培养箱处理1 h，室温孵育5 min，滴加抗荧光淬灭剂并放在载玻片上，荧光显微镜观察拍照，并选取视野计算单个细胞面积及相同面积下细胞数。

1.3 Western blotting检测心肌细胞NF-κB p65蛋白、p38MAPK 蛋白、IL-6和TNF-α的表达

收集各组H9c2细胞于1.5m L EP管中，离心，弃上清，PBS 洗3次，每管中加入含蛋白酶抑制剂的ＲIPA裂解液，离心取上液，BCA法测蛋白浓度，用裂解液调整蛋白浓度，加蛋白loading buffer加热进行变性，每孔上样10 μL。电泳，转膜，封闭，加入相应的一抗、二抗、ECL显色。采用ImageJ软件分析目标蛋白和GAPDH条带的灰度值。以目标蛋白和GAPDH内参蛋白的灰度值的比值来表示目标蛋白的表达水平。本实验重复3 次。

2. 统计学分析

本次实验分析通过SPSS 22.0软件进行统计分析。所有数据以x±s表示三组及以上组别之间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，而两组之间的比较方差齐时采用SNK-q检验，方差不齐时采用Tamhane's T2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3. 结果

3.1 四组心肌细胞免疫荧光染色实验比较

采用α-actinin免疫荧光染色可见高糖诱导组较正常对照组心肌细胞明显肥大，细胞表面积增大，相同视野里心肌细胞个数明显减少，心肌细胞α-actinin成有规则的条索状排列，表明高糖诱导组心肌肥大细胞模型诱导成功。（图2及表7）

                             a                   b                                              

图2 2组心肌细胞免疫荧光染色对比(a正常对照组，b 高糖诱导组)

表1 2组心肌细胞面积和个数对比（x±s）

注：*表示与正常对照组相比，P＜0.05

3.2 2组心肌细胞P38蛋白、NF-κB蛋白、IL-6及TNF-α、miR-146a的表达比较

与正常对照组比较，高糖诱导组心肌细胞p38MAPK蛋白、NF-κB p65 蛋白、IL-6及TNF-α的浓度水平均显著上升。见表2

表2 四组心肌细胞P38蛋白、NF-κB蛋白、IL-6及TNF-α和miR-146a的表达对比（x±s）

注：与正常对照组相比，a P＜0.01，b P＜0.05

4.讨论

糖尿病是由遗传因素与环境因素共同作用、以胰岛素作用障碍或胰岛素分泌缺陷导致的一组以血糖慢性升高为特征的代谢性疾病。在众多疾病当中，糖尿病已成为威胁人类健康的重要疾病之一。糖尿病本身对人体危害不是很大，真正危害人体健康的是其一系列由高血糖引起的并发症。在糖尿病众多的并发症中，心血管病变致死率约占到 50%。DCM是导致糖尿病晚期死亡的重要原因之一[2]。但是，DCM确切的发病机制还不是很清楚，可能涉及到机制包括如炎症反应和氧化应激的异常，心室重构，心肌微循环病变，心肌物质与能量代谢改变，心肌细胞钙代谢和膜电位改变等多个因素，其中炎症反应日渐受到人们关注。

有研究表明在糖尿病心肌病的心肌组织中可见炎症因子的异常表达和大量炎性细胞浸润，许多学者也证实高糖诱导的乳鼠心肌细胞炎症反应程度显著增强。我们的结果也显示，高糖诱导组心肌细胞IL-6及TNF-α的浓度水平均显著上升。糖尿病心肌病中产生炎症反应的机制可能有以下几点：①高糖的刺激作用，在糖尿病心肌病中高糖可直接刺激炎症因子 TNF-α、IL-6、CRP 等的产生。②氧自由基（ROS）的作用，大量 ROS 的产生会通过蛋白激酶 C（PKC）介导核转录因子 NF-κB 的活化，随后调控相关炎症因子的基因表达[4]。③PPAR 与 SIRT1 分别都参与了调节炎症因子的产生，近年来研究表明在心脏中 PPARα 能调控 IκBα（NF-κB 抑制物）的表达[5]。④丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）介导的炎症因子的产生[6]，主要是通过激活p38MAPK /NF-κB信号通路起作用。

丝裂原活化蛋白激酶  (MAPK) 是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。该信号转导通路存在于大多数细胞内，在将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内。其中，p38MAPK活化介导了细胞的炎症反应、增殖、凋亡、生长、分化等多种生理过程，在细胞恶化、转化等病理过程中起重要作用。有研究表明，p38MAPK信号的激活在糖尿病诱导的心脏炎症反应和后续的功能失调过程中起着重要作用。而NF-κB为众多炎性因子共同的转录调节蛋白，也参与调控心肌细胞促炎因子受体、IL-1、TNF-ɑ等的表达和活化。在我们的研究中，高糖诱导组心肌细胞p38MAPK蛋白、NF-κB p65蛋白均较正常对照组明显增高，也表明p38MAPK和NF-κB信号传导通路的激活参与了DCM的发生发展。

参考文献

1. Mischannel CM, Schneppenheim M, Perings S, et al. Left ventricular diastolic dysfunction as an early manifestation of diabetic cardiomyopathy[J] .  Cardiology, 2002, 98(1-2): 33-39.

2. 张茵. 糖尿病性心肌病[J] . 国外医学: 内科学分册, 1999, 26(7): 297-299.

3. Lorenzo O, Picatoste B, Ares-Carrasco S et al. Potential role of nuclear factor κB in diabetic cardiomyopathy[J] . Mediators Inflammation, 2011: 652097. 

4. Zhang N, Andresen BT, Zhang C. Inflammation and reactive oxygen species in cardiovascular disease[J] . World journal of cardiology, 2010, 2(12): 408.

5. Buroker N E, Barboza J, Huang JY. The IκBα gene is a peroxisome proliferator-activated receptor cardiac target gene[J] . Febs Journal, 2009, 276(12): 3247-3255.

6. Li J, Peng L, Du H, et al. The Protective Effect of Beraprost Sodium on Diabetic Cardiomyopathy through the Inhibition of the p38 MAPK Signaling Pathway in High-Fat-Induced SD Rats[J] . International journal of endocrinology, 2014: 901437-901437.