2020年主动监测中沙门氏菌耐药性分析及PFGE分型研究

2020年主动监测中沙门氏菌耐药性分析及PFGE分型研究

代洪梅  郑 文  李征莉

郴州市疾病预防控制中心，湖南  郴州 423000

摘要：目的 分析2020年郴州市食源性疾病主动监测沙门氏菌的血清型分布、耐药特点及分子流行病学特征，为聚集性病例识别和调查提供技术支持。方法对294份腹泻病例标本进行沙门氏菌分离和鉴定、宁波天润沙门氏菌血清试剂盒进行血清分型、PFGE进行分子分型、微量肉汤稀释法进行抗生素的敏感性试验。结果 检出沙门氏菌55株，检出率为18.70 %，属于9个血清型，鼠伤寒沙门氏菌为优势血清型。在抗生素敏感性测试中，对复方新诺明、氯霉素、氨苄西林、四环素的耐药率较高；对头孢类和庆大霉素较敏感，最敏感的为亚胺培南和头孢噻肟，敏感度均达100%。，且多重耐药率达80%。PFGE分子分型试验中， PFGE分型分析得到49种带型，带型间相似度值在44.3%-100%之间。结论 鼠伤寒沙门氏菌是2020年郴州市主动监测病例中沙门氏菌的主要血清型，沙门氏菌的遗传特征多样性，对抗生素的多重耐药和高耐药现象较为严重，应持续监测沙门菌的感染状况和耐药情况。

关键词：主动监测；沙门菌；血清分型；药敏；脉冲场凝胶电泳

1引言

食源性疾病是指通过食物传播的方式和途径致使病原物质进入人体并引发的一种中毒或感染性疾病，是当前世界上最最常见的疾病之一。沙门氏菌属是引起食源性疾病的常见致病菌，是一群寄生在人类和动物肠道中，生化反应和抗原结构相关的革兰阴性杆菌，其血清型有2700种以上[1]，其中能感染人类的沙门血清型约1400多种，主要在第一亚种，即肠道沙门菌肠道亚种中。本研通过对郴州市2020年主动监测病例粪便标本中分离出的55株沙门氏菌进行血清分型、抗生素敏感试验，以此了解沙门氏菌流行和耐药情况，采用脉冲场凝胶电泳，对分离菌株进行分子分型来判断菌株之间的同源性。为郴州市食源性疾病诊断提供病原学确证，指导临床合理用药和识别聚集性病例提供技术支持。

2 材料与方法

2.1标本来源

收集2020年郴州市2家哨点医院中，以腹泻症状为主要感染症状，每日排便大于等于3次，粪便性状为稀便、水样便、粘液便等异常性状的病例标本294份。

2.2试剂和培养基

Cary-Blair运送培养基（青岛海博）、SBG 增菌液 、沙门氏菌显色培养基，上述试剂皆购置青岛海博生物有限公司；沙门氏菌属诊断血清（宁波天润）；GN 鉴定卡（梅里埃），食源性疾病药敏板购自上海复星诊断生物科技有限公司；PFGE 专用琼脂糖 Sea Kem Gold Agarose(美国 LONZA 公司); 0.5M EDTA(PH8.0)、1M Tris-HCl 、10×TBE Buffer、Gelred核酸染料，上述试剂皆产自Solarbio；限制性内切酶 Xba（TAKARA);以上均在有效期内使用。

2.3主要仪器设备

VITEK 2 Compact 微生物鉴定及药敏测试系统和浊度计(生物梅里埃中国有限公司);立式高压灭菌器（雅玛托科学）；生物安全柜NU-425-400E；隔水式恒温培养箱9080（上海一恒）；CHEF-mapper 脉冲场电泳仪、自动凝胶成像仪(美国BIO-RAD)。

2.4方法

2.4.1沙门氏菌的分离及血清学鉴定

参照《2020年国家食源性疾病监测工作手册》沙门氏菌检验操作程序，进行分离鉴定及血清学分型。

2.4.2药敏试验

参照《2020年国家食源性疾病监测工作手册》中“食源性致病菌药敏试验标准操作程序”，选用上海复星食源性疾病药敏板（含有 1 5种抗生素，其中萘啶酸暂无敏感性折点标准，阿奇霉素用于伤寒沙门氏菌）采用微量肉汤稀释法，按照其操作说明对沙门氏菌定量测定最低抑菌浓度（MIC），和结果判读。判断结果分为耐药、中介和敏感3 种。

2.4.3脉冲场凝胶电泳（PFGE）

参照《2020年国家食源性疾病监测工作手册》食源性致病菌PFGE 标准操作程序，小胶块的制备：挑取新鲜菌落制成浊度在4.0-4.5间的菌悬液，经蛋白酶 K处理后与1%SeaKem Gold制成小胶块。裂解：小较快放入裂解液中，置于54℃恒温水浴震荡2h，经TE缓冲液和清水多次洗脱后保存于TE缓冲液中；酶切： 用限制性内切酶 Xba I(50U)37℃酶切2h；电泳：把得到DNA片段用 CHEF-mapper 脉冲场凝胶电泳仪进行电泳分型,用1:10000浓度的 GelRed 染色，用凝胶成像系统拍摄图谱，最后将图谱导入 Bionumerics 7.6 软件进行聚类分析得出树状图。

3结果

3.1沙门氏菌血清分型

从294份食源性疾病监测的腹泻病例标本中检出55株沙门菌，经玻片凝集法鉴定分别属于 B、C、E 3个群9种血清型，其中1株血清型不能确定。鼠伤寒沙门氏菌 39株( 70.90% )，为主要血清型 、其次为森沙门氏菌5株(9.09

% )见表1。

表 1 2020年郴州市食源性疾病监测中沙门氏菌血清型分布

3.2药敏结果分析

55株沙门菌对13种抗生素耐药程度不尽相同，耐药率较高的依次为四环素（87.2%）、氨苄西林（60%）、氯霉素（49.1%）；对头孢类和庆大霉素较敏感，最敏感的为亚胺培南和头孢噻肟，敏感度均达100%；头孢西丁（96.4%）头孢他啶（96.36%）、庆大霉素（92.7%），见表2。

根据多重耐药结果可知，对13种抗生素中的1种以上耐药的沙门氏菌占80% ( 44/55)，其中耐2种抗生素的菌株最多，多达 12株。40% ( 22 /55) 的沙门菌对3类及以上的抗生素耐药。仅有 1 株未分型沙门菌对13种抗生素全部敏感，见表3。

表2  2020年郴州市食源性疾病监测中沙门氏菌耐药情况ｎ（％）

表32020年郴州市食源性疾病监测中沙门氏菌耐药谱

3.3 PFGE分型结果

3.3.1沙门氏菌 PFGE聚类结果

通过对55株沙门氏菌经限制性内切酶 Xba I 酶切后,除3株因DNA降解不能分型外，其他52株沙门氏菌按照100%的相似度得到了49种PFGE带型,分别命名为 P01-P49型, 其中 P12 型、P25、P26各包含2株菌, 相似度为 100%,其余各型均为 1 株菌,菌株间相似系数44.3%-96.6%之间，见图1。

图1  2020年郴州市食源性疾病监测中52株沙门氏菌PFGE聚类分型图谱

3.3.2 主要血清型 PFGE分型结果

39株鼠伤寒沙门氏菌PFGE 型相似系数为44.3％ ～100．0％，按照 100% 的相似度可分成36个PFGE 型，具有相同带型的分别为P012型、P025型和P026型各包含2株菌；5株罗森沙门氏菌分成了5个带型 ，其中4株相似系数83.7％～91.7％。

3.3.3耐药测定结果

不同的耐药表型菌株可以有相同的 PFGE 型( 如 P17、P20 型和 P28 型等) ，拥有完全相同的耐药表型菌株可以有不同

PFGE 型( 如 P23 型和 35 型) 。

4分析和讨论

血清学分型是沙门菌的传统分型方法，血清型的正确鉴定对确定沙门菌病的感染源及控制减少发病率具有重要意义［2］。郴州市2020年食源性疾病主动监测从294份食腹泻患者粪便标本中检出沙门菌55株，检出率为18.7%，高于本省7.06%平均检出率[10]。沙门氏菌分别属于 B、C、E 3个群 9 个血清型, 优势血清型主要是为鼠伤寒沙门氏菌, 占 70.90%, 该结果与长沙［3］、广 州 市［4］、深圳市［5］、甘肃省［6］腹泻病人沙门氏菌血清结果基本一致。

近年来，畜牧业养殖和临床抗生素的滥用导致了许多耐药细菌的产生［7］，甚至出现了多重耐药细菌，沙门氏菌的耐药性日益严重，给临床治疗带来了更大的挑战。分离的55株沙门氏菌的多重耐药率达80% ，对常见的传统药物产生了较高的耐药性，对头孢类和亚胺培南敏感性较高。与王茂起等[8]2004年报道的 2001年 中国食源性致病菌及其耐药性主动监测研究结果相比，氨苄西林、四环素均由高度敏感，转为高度耐药，全部敏感的庆大霉素和环丙沙星也出现了中介和耐药性。从耐药谱来看55株菌共产生２4个耐药谱，优势耐药谱为AMP+AMS+TET+CHL+CFZ+SXT，药物种类达到６种，近半数菌株对4种及以上抗生素耐药，提示郴州市沙门氏菌耐药较情况较为严峻。

PFGE 分型方法为种非常有效的分子分型的方法，弥补了单纯的沙门氏菌血清分型鉴定的不足。从本次PFGE分型结果可见，39株鼠伤寒沙门氏菌大部分聚集为5簇，基因同源性分别为89.4%、85.7%、84.3%、83.8%、85.2%；5株罗森沙门氏菌中3株为聚集1簇 ，基因相似系数为 88．5％。按照 F C Tenover等提出的菌株同源性判别标准[9] ，相似值0．85以上的菌株可以判断与流行病学相关 ，说明部分菌株间存在同源性，整体存在多个污染来源。不同血清型菌株的PFGE结果具有多态性 ，相似系数44.3％。

对比PFGE分型和耐药谱测定结果 ，不同的耐药表型菌株可以有相同的 PFGE 型( 如 P17、P20 型和 P28 型等) ，拥有完全相同的耐药表型菌株可以有不同 PFGE 型( 如 P23 型和 35 型) 。未发现PFGE 型与耐药谱之间有直接的关联。

综上所述，本研究显示了郴州市2020年主动监测腹泻病例的沙门菌的血清型分布，耐药谱及 PFGE 型别分布特征，并初步建立了郴州市腹泻人群肠道沙门氏菌PFGE分子分型数据库，但由于分离菌株数量较少，尚需对其他年份分离的沙门氏菌进行PFGE分子分型，进一步完善沙门氏菌 ＰＦＧＥ 分型数据库，为今后实验室监测、鉴定溯源及防控预警提供技术支持和数据参考。与此同时，郴州沙门氏菌的耐药现象不容忽视，相关监管部门应加强沙门氏菌耐药性监测和管理，规范抗生素的合理使用，为食源性疾病的防治提供坚强后盾。

参考文献

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