简介:摘要目的探讨白细胞介素-33(IL-33)对脂多糖(LPS)诱导的大鼠心脏微血管内皮细胞(RCMECs)通透性的影响。方法体外培养RCMECs,分为空白对照组、LPS组、IL-33组和LPS+IL-33组。用细胞计数试剂(CCK8)检测IL-33对RCMECs增殖的影响。异硫氰酸荧光素(FITC)-葡聚糖法检测4组单层RCMECs通透性。Western Blot检测4组RCMECs中血管内皮钙黏蛋白、Ras同源基因家族(Rho)成员A(RhoA)、磷酸化Rho相关含卷曲螺旋蛋白激酶(p-ROCK2)蛋白表达。高通量测序比较LPS组和LPS+IL-33组的差异基因表达,并对差异基因进行基因本体(GO)富集分析。结果10~50 ng/ml的IL-33对RCMECs增殖无显著影响(P>0.05)。与空白对照组比,LPS组RCMECs通透性增加(相对灰度值1.404±0.029 比 1.000±0.200,P<0.05),血管内皮钙黏蛋白表达显著下调(相对灰度值0.429 5±0.012 9 比 0.594 9±0.014 2, P<0.05);而与LPS组比,LPS+IL-33组可降低RCMECs通透性(相对灰度值0.948±0.013,P<0.01),上调血管内皮钙黏蛋白表达(相对灰度值0.549 1±0.012 0,P<0.005)。与空白对照组比,LPS组RhoA(相对灰度值0.211 4±0.009 9 比 0.135 0±0.007 6,P<0.000 1)、p-ROCK(相对灰度值0.656 3±0.013 2 比 0.503 6±0.036 2,P<0.000 1,)蛋白表达上调;与LPS组比,LPS+IL-33组RhoA(相对灰度值 0.157 7±0.010 7,P=0.000 2)、p-ROCK(相对灰度值0.427 7±0.003 8,P<0.000 1)蛋白表达降低。高通量测序发现,LPS组、LPS+IL-33组下调的差异基因与细胞骨架及Rho信号通路相关。结论IL-33可能通过抑制Rho/Rho相关含卷曲螺旋蛋白激酶信号通路RhoA、p-ROCK蛋白表达,改善LPS诱导的心脏微血管内皮细胞的高通透性。
简介:摘要目的研究芍药苷干预对脓毒症大鼠心肌损伤的影响。方法采用随机数字表法将SD大鼠分为4组,每组10只。(1)对照组:大鼠腹腔注射1.4 ml生理盐水;(2)二甲基亚砜组:大鼠腹腔注射5%二甲基亚砜溶液1.4 ml;(3)脓毒症模型组:大鼠腹腔注射1.4 ml生理盐水,1 h后腹腔注射0.1 ml(5 mg/kg)脂糖造模;(4)芍药苷干预组:大鼠腹腔注射1.4 ml芍药苷(70 mg/kg),1 h后腹腔注射0.1 ml(5 mg/kg)脂多糖造模。24 h后处死4组大鼠。酶联免疫吸附测定(ELISA)法测4组大鼠血清心肌肌钙蛋白I(cTnI)及心肌组织中肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素(IL)-6、IL-1β、趋化因子C-X-C基序配体1(CXCL1)、趋化因子C-X-C基序配体2(CXCL2)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)水平,伊文思蓝法测4组大鼠心肌组织中伊文思蓝含量;实时荧光定量聚合酶链式反应法测4组大鼠心肌组织中TNFα、IL-6、IL-1β、CXCL1、CXCL2、VCAM-1mRNA表达;Western-Blot法测血管内皮钙黏蛋白、丝裂原活化蛋白激酶p38(p38MAPK)、磷酸化p38MAPK(P-p38MAPK)、磷酸化Src蛋白(P-Src)、Ras相关C3肉毒素底物1(Rac1)蛋白表达。结果与对照组比,脓毒症模型组cTnI增高[(312.9±17.9)pg/ml比(174.4±17.7)pg/ml,P<0.05],伊文思蓝含量上升[(23.8±2.9)μg/g 比(5.2±2.0)μg/g,P<0.05],心肌炎性细胞浸润明显;与脓毒症模型组比,芍药苷干预组cTnI明显降低[(227.7±15.9)pg/ml,P<0.05],伊文思蓝含量显著下降[(13.2±2.3)μg/g,P<0.05],心肌炎性细胞浸润减轻。与对照组比,脓毒症模型组TNFα、IL-6、IL-1β、CXCL1、CXCL2、VCAM-1增高;与脓毒症模型组比,芍药苷干预组TNFα[(63.39±9.55)pg/ml 比(126.54±19.17)pg/ml,P<0.05]、IL-6[(64.03±8.82)pg/ml 比(85.60±9.52)pg/ml,P<0.05]、IL-1β[(69.52±9.23)pg/ml比(130.45±15.10)pg/ml,P<0.05]、CXCL1[(2 600.19±379.54)pg/ml比(4 903.89±533.42)pg/ml,P<0.05]、CXCL2[(93.71±10.83)pg/ml比(127.24±13.92)pg/ml,P<0.05]、VCAM-1[(112.22±13.49)pg/ml 比(149.32±15.65 pg/ml),P<0.05]显著下降。与对照组比,脓毒症模型组TNFα、IL-6、IL-1β、CXCL1、CXCL2、VCAM-1 mRNA表达增高;与脓毒症模型组比,芍药苷干预组IL-6(相对表达量1.271±0.139 比 1.920±0.191,P<0.05)、IL-1β(相对表达量1.180±0.130 比 1.817±0.191,P<0.05)、VCAM-1(相对表达量1.088±0.144 比 1.460±0.166,P<0.05)mRNA表达降低。与对照组比,脓毒症模型组P-p38MAPK、P-Src表达增加,血管内皮钙黏蛋白表达降低。与脓毒症模型组比,芍药苷干预组p38MAPK(相对表达量1.125±0.078 比 1.520±0.164,P<0.05)、P-p38MAPK(相对表达量 1.639±0.133 比 2.112±0.227,P<0.05)表达均明显下降,血管内皮钙黏蛋白表达升高。结论芍药苷能改善脓毒症大鼠心脏微血管内皮通透性,抑制炎症相关蛋白及基因的分泌和表达,可能与芍药苷抑制Src/血管内皮钙黏蛋白通路有关。
简介:摘要目的探索脂多糖(LPS)对大鼠心脏微血管内皮细胞(rCMECs)转录组的调节作用。方法对照组(正常培养rCMECs),LPS组(100 ng/mL LPS处理6 h的rCMECs),每组进行3个生物学重复转录组测序。得到差异基因后,使用实时定量PCR对部分差异基因mRNA的表达进行验证。分别对上调和下调基因进行GO和KEGG富集,并对差异基因进行共表达网络分析。采用独立t检验进行统计学分析。结果LPS处理后,265个基因表达上调,118个基因的表达下调。前10个最显著上调基因为:Mt2a、Cyp7b1、Sod2、Icam1、Ccl2、AC128848.1、Mt1、Cebpd、Serpinb2和Tnfrsf11b。前10个最显著下调基因为:Cavin2、Ankrd1、Edn1、Prss35、Lmod1、Dhrs3、Ttc22、Sema6a、Map2k3和Sema7a。定量PCR的结果表明Mt2a、Sod、Ccl2、Cxcl1、Icam1和Vcaml基因的表达得到了上调(P均< 0.01);而Cavin2、Ankrd1、Edn1和Prss35基因表达下调(P均< 0.05)。GO和KEGG富集的结果表明,上调基因与内皮细胞对炎性免疫细胞的趋化作用和黏附作用密切相关;而下调基因则是与钙离子信号和G蛋白相关通路以及内皮通透性增加有关。此外,差异基因进行共表达网络分析发现Sod2处于核心位置,提示其可能与LPS诱导的rCMECs的各种变化密切相关。结论LPS调控了rCMECs中大量与炎性免疫细胞进入心肌组织相关基因的表达。
简介:摘要目的探讨芍药苷对脓毒症心脏微血管内皮细胞(CMECs)通透性的影响及机制。方法体外分离并原代培养大鼠CMECs细胞,待细胞进入对数生长期用于实验。采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)筛选出芍药苷的安全有效浓度10、20、40 μmol/L。将细胞分为空白对照组、脂多糖(LPS)组及低、中、高浓度芍药苷预处理组。空白对照组用完全培养基培养;LPS组在完全培养基中加入1 mg/L的LPS刺激细胞;芍药苷预处理各组分别于LPS刺激前4 h加入10、20、40 μmol/L芍药苷进行预处理。各组细胞于LPS刺激后继续培养24 h,采用辣根过氧化物酶(HRP)法检测大鼠CMECs细胞通透性;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清液中CXC趋化因子配体(CXCL1、CXCL2)水平;采用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测细胞中CXCL1、CXCL2的mRNA表达;采用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测细胞中磷酸化Src(p-Src)、血管内皮-钙黏蛋白(VE-cadherin)、磷酸化丝裂素活化蛋白激酶(p-MAPK)的蛋白表达。结果与空白对照组相比,LPS组大鼠CMECs细胞通透性明显增加;经不同浓度芍药苷预处理后细胞通透性均有一定程度改善,以40 μmol/L芍药苷组改善最明显,与LPS组比较差异有统计学意义(A值:1.61±0.07比2.13±0.06,P<0.01)。ELISA结果显示,空白对照组大鼠CMECs细胞上清液中有适量CXCL1、CXCL2分泌;但在LPS诱导下,细胞上清液中CXCL1、CXCL2分泌量明显增加;给予不同浓度芍药苷预处理后细胞上清液中CXCL1、CXCL2的分泌量均明显减少,其中40 μmol/L芍药苷对CXCL1的抑制作用最佳,20 μmol/L芍药苷对CXCL2的抑制作用最佳,与LPS组比较差异均有统计学意义〔CXCL1(ng/L):337.51±68.04比829.86±65.06,CXCL2(ng/L):4.48±0.11比9.41±0.70,均P<0.01〕。RT-qPCR结果显示,大鼠CMECs细胞中CXCL1、CXCL2的mRNA表达与ELISA结果一致,表现为LPS能够诱导大鼠CMECs细胞中CXCL1、CXCL2的mRNA表达增加;而不同浓度芍药苷预处理后能够明显降低CXCL1、CXCL2的mRNA表达,40 μmol/L芍药苷对CXCL1 mRNA表达的抑制效果最佳,20 μmol/L芍药苷对CXCL2 mRNA表达的抑制效果最佳,与LPS组比较差异均有统计学意义〔CXCL1 mRNA(2-ΔΔCt):0.543±0.004比0.812±0.089,CXCL2 mRNA(2-ΔΔCt):10.52±0.71比17.68±1.09,均P<0.01〕。Western Blot结果显示,空白对照组大鼠CMECs细胞中有适量p-Src、VE-cadherin和p-MAPK蛋白表达;LPS刺激后大鼠CMECs细胞中p-Src、p-MAPK蛋白表达明显增加,而VE-cadherin蛋白表达明显下降;经不同浓度芍药苷预处理后,细胞中p-Src、p-MAPK蛋白表达有不同程度降低,但VE-cadherin蛋白表达则呈升高趋势,以40 μmol/L芍药苷组效果最佳,与LPS组比较差异均有统计学意义〔p-Src蛋白(p-Src/GAPDH):1.02±0.09比1.29±0.05,p-MAPK蛋白(p-MAPK/GAPDH):0.24±0.02比0.62±0.02,VE-cadherin蛋白(VE-cadherin/GAPDH):0.64±0.03比0.31±0.02,均P<0.01〕。结论芍药苷能够通过调节CMECs细胞中Src/VE-cadherin通路,抑制炎症相关蛋白及趋化因子的表达和分泌,改善LPS诱导的CMECs细胞通透性。