简介：摘要利用在原核生物中观察到的规律成簇的间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）与相关的Cas（CRISPR- associated proteins）蛋白构成CRISPR-Cas系统作为真核细胞中的基因编辑工具为近年研究热点。效应蛋白由多个Cas蛋白组成，包括两个大类五型系统。Cas蛋白结合特定的核酸序列，具有核酸酶的功能用于可编程基因组编辑和表观遗传调控，同时在疾病诊断方面也有很好的发展前景。其中Cas6是一种独立于金属的单转位酶，依附在crRNA裂解产物上，可识别并在crRNA转录前的重复序列中裂解单个磷酸二酯键。核糖核酸内切酶Cas9为RNA引导的DNA裂解酶，是目前应用最广泛的基因编辑工具，同时在感染性疾病检测、癌性病毒感染的消除或灭活、肿瘤免疫治疗、肿瘤基因组和表观基因组的调控等方面显示出巨大的应用前景。RNA引导的核酸内切酶Cas12a具有两种不同的核酸酶活性，且该双重催化活性已被用于多重基因编辑。Cas12a的显著特性使其应用于目标DNA与RNA快速检测，成为CRISPR-Cas基因组编辑工具包的补充。RNA引导的RNA靶向核酸内切酶Cas13a是RNA引导、RNA激活的RNA酶，已被开发为RNA检测、RNA成像和RNA调控的强大工具，同时利用Cas13a构建高灵敏度及特异度的检测方法也可为感染性疾病在诊断过程中提供重要的理论依据。由此展开对CRISPR-Cas系统相关的Cas蛋白的深入研究，同时对上述系统在不同疾病中的重要应用等进行阐述，有助于为各项研究提供新思路，新方法。

简介：摘要规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)和CRISPR相关蛋白9(CRISPR associated protein，Cas9)组成的CRISPR/Cas9系统是大多数细菌和古细菌的一种免疫系统。该系统在动物模型构建、基因治疗和基因表达调控等众多领域发挥着强大的作用。但该系统的脱靶效应等原因所导致的效率低下和安全性问题一直是人们研究的重点。本文主要对CRISPR/Cas9系统从sgRNA、Cas9蛋白、递送系统、DSB修复通路、脱靶检测手段以及碱基编辑技术六个方面提高其编辑效率的改进方法进行综述。

简介：摘要目前核酸检测技术已被广泛应用于临床实验室诊断，常规检测技术如实时荧光定量PCR技术耗时长且依赖特定的仪器设备。成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）系统是细菌和古细菌在与病毒斗争过程中获得的适应性免疫防御机制，已被发展成强大的基因组编辑技术。最近CRISPR领域的先驱团队基于Cas13a、Cas12a和新发现的Cas14蛋白开发出SHERLOCK、DETECTR等新型核酸检测工具，在传染性疾病的快速诊断、癌症中基因突变的检测和基因分型等方面意义重大，其灵敏度高、特异性强且快速经济，在临床分子诊断领域具有巨大潜力。本文综述了CRISPR/Cas系统的作用机制及新型诊断平台的原理和应用进展，总结了新型检测技术的优缺点并对其发展前景进行展望。

简介：摘要成簇规律间隔短回文重复序列系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)/以及CRISPR相关蛋白9(Cas9)系统是一种新型的基因组编辑技术，具有基因敲除效率高、精准定位、易于操作、实验周期短、成本低廉等优点。CRISPR/Cas9系统的出现为眼病尤其是晶状体相关疾病的诊治提供了新的思路，在先天性白内障发病机制的研究及治疗、先天性白内障模型的构建、晶状体相关性疾病突变基因位点的确定、后发性白内障防治等方面均有一定的作用。(国际眼科纵览，2020, 44: 29-33)

简介：AbstractObjective:The asparagine-linked glycosylation 13 homolog (Alg13) has been identified as causative for congenital disorders of glycosylation type I with epilepsy. The aim of this study was to determine whether mice carrying a mutated version of Alg13 could be used as a model for epileptic encephalopathies or congenital disorders of glycosylation type I.Methods:A model of epileptic encephalopathy was established in C57BL/6 mice by introducing mutations in Alg13 via the clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system. All surgical procedures were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of Shanghai Jiao Tong University (A2016084) on October 8, 2016.Results:Mice with 3 different mutations, Alg13-54nt, Alg13-5nt and Alg13-4nt, all of which are located in Alg13 transcript variant 1, were created. The Alg13-5nt mice exhibited spontaneous seizures similar to patients with Alg13 mutations, suggesting that they could be used as a model for epilepsy. Western blot analysis demonstrated that Alg13-5nt mice had lower levels of Alg13 expression than wild-type mice. Video observations showed that two of the 17 Alg13-5nt mice had stage 5 seizures involving jumping and falling, while 12 had stage 3 seizures with head nodding.Conclusion:The Alg13 mouse model provides an outstanding tool for studying epileptic encephalopathies and investigating different aspects of defects in glycosylation or other post-translational modification that cannot be assessed in patients or cell culture systems.

简介：摘要目的构建线粒体抗病毒信号(mitochondrial antiviral signaling, MAVS)和核因子κB1(nuclear factor kappa B1, NFκB1)基因敲除的犬肾细胞系(Madin-Daby canine kidney cells, MDCK)，对细胞系的生长特性、流感病毒(influenza virus, Flu)的增殖特性进行初步鉴定。方法采用CRISPR/Cas9技术，将MDCK细胞的MAVS和NFκB1基因敲除，获得稳定的敲除细胞系。接种Flu并检测培养上清中病毒的血凝(hemagglutinination, HA)滴度和TCID50滴度，与野生MDCK细胞进行比较。结果获得2株稳定敲除的MDCK细胞系MDCK-MAVS－和MDCK-NFκB1－，与野生MDCK细胞同样为贴壁的上皮样细胞。接种Flu后，2株敲除细胞系测定的病毒HA滴度与野生细胞相比无明显差异，TCID50分别比野生MDCK细胞系提高了9.5倍和10倍，其差异有统计学意义(P＝0.0316)。结论本研究构建的2株基因敲除细胞系MDCK-MAVS－和MDCK-NFκB1－能够提高Flu的感染力，为Flu的分离培养提供了新的候选细胞系。

简介：摘要目的通过突变整合于宿主细胞中的人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)16型的E6、E7致癌基因，探索预防和治疗宫颈癌的新方法。方法以SiHa细胞系为研究对象，设计靶向其内整合的HPV16 E6和E7基因的小引导RNA(small guide RNA，sgRNA)，将其克隆入CRISPR/Cas9质粒，并应用其将E6、E7基因敲除，随后应用错位酶切法和克隆测序检测突变效果，并用细胞迁移与侵袭实验检测细胞的侵袭力。结果设计的sgRNA被克隆入CRISPR/Cas9质粒，经测序克隆正确。该质粒转染SiHa细胞后，可以引发靶点DNA的突变，致使E6和E7基因密码子改变，无法正确表达。E6、E7突变后SiHa细胞侵袭及增殖能力下降(t检验，pCas9组与psgE6-1-1-Cas9组相比，P＝0.0006; pCas9组与psgE7-1-2-Cas9组相比，P＝0.0007)，促进肿瘤抑制因子P53的表达恢复，细胞的恶性度降低。

简介：摘要目的构建表达视觉系统同源框2(VSX2)增强绿色荧光蛋白(eGFP)报告基因的人诱导多能干细胞系(hiPSCs)。方法根据成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)技术原理，设计VSX2的小向导RNA(sgRNA)，构建敲除质粒及包含左右同源臂的P2A-eGFP供体质粒；2个质粒经测序鉴定后电转野生BC1-hiPSCs细胞系，采用嘌呤霉素筛选获得单克隆，扩增培养并鉴定。采用PCR和Sanger测序鉴定基因型；采用核型分析法分析报告细胞系核型；采用STR法排除细胞交叉污染；采用免疫荧光法及逆转录PCR法检测报告细胞系的多能干细胞分子标志物的表达；通过体外三胚层形成实验鉴定报告细胞系向三胚层分化的能力；应用3D视网膜类器官诱导技术获得视网膜类器官，并采用免疫荧光染色法评价VSX2蛋白与eGFP的共定位情况。结果电转后通过PCR鉴定和Sanger测序成功筛选到1株含有VSX2-eGFP报告基因的hiPSC系。核型分析结果显示该报告细胞系核型正常。STR鉴定结果表明，BC1-VSX2eGFP-iPSCs无细胞系交叉污染。逆转录PCR检测和免疫荧光染色表明，BC1-VSX2eGFP-iPSCs中iPSCs标志物基因和蛋白表达阳性，包括NANOG、OCT4、SOX2、DNMT3B和GDF3 mRNA以及NANOG、OCT4、SSEA4和TRA-1-60蛋白。免疫荧光染色表明，由BC1-VSX2eGFP-iPSCs分化的三胚层组织中内胚层标志物甲胎蛋白(AFP)、中胚层标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和外胚层标志物神经细胞特异性微管蛋白(TUJ1)表达均为阳性；eGFP与VSX2共表达于视网膜类器官的神经视网膜。结论成功构建1株表达VSX2-eGFP报告基因的hiPSCs，该细胞系可实时指示VSX2蛋白的时空表达变化，为视网膜发育、疾病机制研究及治疗方法评价提供有力工具。

简介：摘要目的构建跨膜蛋白超家族6成员2（Tm6sf2） E167K基因敲入小鼠模型。方法构建同时表达针对小鼠Tm6sf2基因特定位点的单链向导RNA Cas9的质粒和携带Tm6sf2 E167K片段的Donor质粒，将上述2质粒一起注射入小鼠受精卵，通过PCR检测和测序验证得到F0代阳性小鼠。统计F2代中野生（Wt）、杂合和敲入（KI）3种基因型小鼠的存活数量。选取F2代同窝Wt和KI雄性小鼠（8只/组）给予普通饮食8周，每周记录小鼠的体质量，检测两种小鼠葡萄糖代谢和脂质代谢等指标。组间比较采用独立样本t检验。结果基因型检测和测序结果表明Tm6sf2 E167K基因敲入小鼠模型建立成功。KI小鼠不存在胚胎纯合致死的表型。哺乳期内KI小鼠较Wt小鼠的体质量升高，两组差异有统计学意义（P < 0.05）。KI小鼠的空腹血糖（9.50±0.33）mmol/L较Wt小鼠的空腹血糖（7.80±0.30）mmol/L升高，两组差异有统计学意义（P < 0.05）；KI小鼠的口服葡萄糖耐量试验2 h血糖（9.20±0.51）mmol/L较Wt小鼠的口服葡萄糖耐量试验2 h血糖（7.60±0.18）mmol/L升高，两组差异有统计学意义（P < 0.05）。KI小鼠的肝脏甘油三酯含量（8.40±0.55）mg/g较Wt小鼠的肝脏甘油三酯含量（7.30±0.63）mg/g升高，但差异无统计学意义（P < 0.05）；两种小鼠的血浆甘油三酯水平差异无统计学意义（P > 0.05）；肝脏油红O染色结果显示KI小鼠较Wt小鼠的肝小叶中央区有更多的脂质累积。结论Tm6sf2 E167K基因敲入小鼠构建成功。Tm6sf2 E167K基因敲入可引起小鼠葡萄糖代谢的异常，促进肝脏脂肪变性的发生。