简介:摘要目的构建细胞凋亡受体通路相关蛋白FasL表达的RNA干扰(RNAi)质粒,为研究FasL参与的细胞信号通路提供稳定转染细胞的RNA干扰质粒。方法选取FasL基因的19nt特异性序列,设计针对FasL的shRNA序列,应用基因重组技术克隆到pSilencer1.0-U6表达载体中,EcoRI和ApaI进行双酶切和DNA测序鉴定重组克隆,在脂质体的介导下包含FasL基因RNAi的重组载体转染脐静脉血管内皮细胞,转染48h后,收集细胞裂解液,Westernblotting分析对照组与转染组FasL蛋白的表达水平。结果双酶切证实shRNA正确插入pSilencer1.0-U6质粒,DNA测序证实插入的序列正确;FasL基因RNAi的载体转染血管内皮细胞成功;Westernblotting结果显示与空质粒对照组比转染组细胞FasL表达下调。结论成功构建人FasL基因RNA质粒,为研究FasL参与的细胞信号通路提供了稳定的转染细胞载体。
简介:目的构建ITIH4基因重组慢病毒干扰系统。方法选取干扰效果最佳的siRNA片段,设计shRNA结构,退火反应形成双链后采用T4DNA连结酶与线性化慢病毒载体Psico连接,转化大肠杆菌后提取质粒,并经质粒DNA测序和PCR鉴定重组质粒构建是否成功,转染293T细胞并测定培养上液的病毒滴度。结果测序结果显示,重组慢病毒干扰载体Psico/ITIH4测序结果与设计的shRNA序列完全一致,转染293T细胞后,其病毒滴度为9.5×10^3IU/mL。结论成功地构建了ITIH4基因的重组慢病毒系统,为今后深入研究ITIH4奠定了基础。
简介:摘要 研究表明HOX基因与白血病的发生发展有着密切联系。HOX基因与早期造血干细胞的功能有关,又参与了后期造血细胞的分化与系定向分化过程,其表达异常可导致白血病的发生。RNA干扰技术是双链RNA(double strand RNA,dsRNA)介导的序列特异性转录后引起同源靶基因表达沉默,从而阻断靶基因的表达,是一种高效的基因阻断技术。利用RNAi技术,抑制HOX基因的表达,可能成为白血病基因治疗的新途径,本文对RNA干扰HOX基因用于白血病基因治疗的研究作一综述。
简介:摘要目的构建人干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes, STING)沉默子的荧光素酶报告质粒,在人胚肾细胞(HEK293T)和人类宫颈癌细胞(HeLa)中检测荧光素酶活性,生物信息学预测其可能结合的转录因子并通过实验验证。方法通过PCR扩增人STING-5-1a(-124~+267,相对于转录起始位点,TSS: 0)和STING-5-2a(-124~+168)区域,亚克隆至pGL3-Basic质粒;将人STING沉默子区域STING-5-1b(+169~+267)正向反向亚克隆至pGL3-Control质粒(pGL3-C-5-1b-positive/negative),并把STING-5-1b分为两段互补片段,亚克隆至pGL3-Control载体上,命名为pGL3-C-STING-5-1b-α(+169~+209)/pGL3-C-STING-5-1b-β(+210~+267),双荧光素酶报告活性分析检测上述重组质粒在HEK293T和HeLa中的活性。应用生物信息学方法预测人STING沉默子的转录因子结合位点,将预测结合位点进行多点突变,检测荧光素酶活性。敲低转录因子,免疫印迹试验检测STING的表达水平。染色体免疫共沉淀反应进一步验证转录因子与人STING沉默子的结合。结果核酸测序证实,上述重组质粒构建成功。截短STING-5-1b(+169~+267)片段后相对荧光素酶活性上升。同时,与pGL3-Control质粒相比,pGL3-C-5-1b-positive重组质粒的相对荧光素酶活性下降(P<0.05),其中,STING-5-1b-β(+210~+267)序列起主要抑制作用。应用生物信息学软件预测发现转录因子PR结构域锌指蛋白4(PRDM4)、Thanatos相关蛋白1(THAP1)、TEA域转录因子1(TEAD1)、核受体亚家族4 A组成员1(NR4A1)、类Krueppel因子4(KLF4)和叉头转录蛋白O3(FOXO3)可能与人STING沉默子区域(+210~+267)结合。对上述转录因子的结合位点进行多点突变构建突变体并转染至HEK293T和HeLa,发现THAP1-Mut和TEAD1-Mut的相对荧光素酶活性显著上升,提示STING沉默子可能含有THAP1和TEAD1的结合位点。将转录因子THAP1和TEAD1敲低后,STING的表达水平有显著上升。染色体免疫共沉淀试验表明,转录因子TEAD1和THAP1在细胞内与人STING沉默子区域结合。结论本实验成功构建了人STING沉默子荧光素酶报告质粒,通过活性比较,推测人STING的核心沉默子区位于+210~+267区域,通过生物信息学分析及点突变实验初步确定人STING沉默子可能含有的潜在转录因子结合位点。并使用免疫印迹试验和染色体免疫共沉淀进一步证实转录因子TEAD1和THAP1与人STING沉默子的结合,为后续研究提供实验资料。
简介:目的构建大鼠nelin基因干扰质粒并对其进行体外抑制效果验证,为研究nelin在心脏发育、心肌肥厚、心衰及其它心脏疾病中的作用提供有效的研究工具。方法提取大鼠心肌组织RNA,逆转录为cDNA,设计合成含BamHI和EcoRI酶切位点的引物,以大鼠cDNA为模板PCR扩增获得nelin基因,定向克隆入pEGFP-N1-3FLAG载体,测序验证。以克隆得到的大鼠nelin基因为模板,设计合成候选干扰序列,亚克隆至pGCSIL-U6载体,获得干扰质粒。以nelin基因干扰质粒和重组表达质粒共转染HEK293T细胞,WesternBlot方法检测干扰效果。结果成功克隆了大鼠nelin基因并构建了nelin基因重组表达载体pEGFP-N1-3FLAG-rNelin。设计构建的4个干扰质粒(靶位点分别为+370-388位,+376-394位,+545-563位,+1206-1224,命名为pGCSIL-U6-nelin/siteⅠ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ)均可显著降低nelin基因的表达,尤以靶向(+370-388位)位点即pGCSIL-U6/nelin-siteI质粒的干扰效果最佳。结论本实验构建的大鼠nelin基因特异性干扰质粒能从蛋白水平上高效特异地抑制ne-lin基因表达,为进一步开展其功能研究奠定了基础。
简介:本研究以拟南芥DNA为模板,将罗勒烯合成酶AtTPS03基因的一个目的片段克隆到T-载体上。对克隆片段测序后,进行Blast比对,结果目的片段的序列与GenBank上报道的序列同源性达到100%。根据RNA干扰的基本原理,将目的片段正反向连到干扰载体pFGC5941查尔酮内含子的两侧,经限制性酶切和PCR扩增检测,证明已成功构建了干扰载体P-2AT03。利用农杆菌介导的浸花法转化拟南芥。收获的种子在含草丁膦的培养基上筛选抗性苗,通过对抗性苗的PCR检测,已成功获得了12株转基因苗。这些转基因苗为进一步研究罗勒烯和罗勒烯合成酶的功能奠定了良好基础。
简介:摘要目的建立儿童干扰素刺激基因(ISG)表达检测方法,确立参考值范围,初步探讨其临床应用价值。方法纳入2017年11月至2021年9月就诊于北京协和医院儿科的Ⅰ型干扰素病患者作为疾病组,同时纳入健康儿童作为对照组。疾病组共纳入18例患儿,其中男性8例,女性10例,共采集血液样本25份,首次检测的中位年龄为8.5岁。对照组共纳入28名健康儿童,年龄1~18岁,中位年龄10.5岁,其中男性15名,女性13名。分别提取疾病组和对照组外周血总RNA并逆转录为互补DNA(cDNA)。以β肌动蛋白基因(β-Actin)和鸟氨酸脱羧酶抗酶基因(OAZ)为内参,采用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测干扰素诱导的四肽重复蛋白1基因(IFIT1)、干扰素α诱导蛋白27基因(IFI27)、干扰素诱导蛋白44样基因(IFI44L)、干扰素刺激基因15(ISG15)、唾液酸结合的免疫球蛋白样凝集素1基因(SIGLEC1)、含有S-腺苷甲硫氨酸结构域2基因(RSAD2)的相对表达量,以6个ISG的中值为干扰素评分(IS)。去除正常对照中表达明显异常的样本,将其他样本的cDNA混合作为参照,重新检测各样本并计算IS,将大于对照x¯+2s的IS结果判断为异常。用独立样本t检验或Mann-Whitney U检验比较组内和组间IS的差异。结果对照组IS均值为1.046,标准差0.755,IS截断值为2.556。18例Ⅰ型干扰素病患者组IS异常的有15例(15/18),IS均值为27.010。与对照组相比,干扰素疾病患者组IS明显升高(t=4.247,P=0.000 1)。该检测方法的准确度为91.30%(42/46),精密度为7.47%(0.084/1.124),敏感度为15/18,特异度为96.43%(27/28)。结论本研究通过ISG表达的检测并计算IS,为临床筛查以及动态监测Ⅰ型干扰素疾病变化提供了新的可靠的手段。
简介:目的构建shRNA并干扰肝癌HepG2细胞中BC047440基因,观察其对肝癌HepG2细胞增殖的影响。方法根据BC047440基因序列,设计和合成两条特异表达该基因shRNA序列并克隆载体pGenesil-1,转染肝癌HepG2细胞并用定量PCR观察抑制BC047440基因表达的效果,并通过MTr法和流式细胞仪检测细胞增殖及细胞周期的变化。结果酶切和序列测定提示成功构建了特异表达BC047440基因的shRNA1和shRNA2两个质粒。shRNA1和shRNA2对BC047440mRNA的抑制率分别为80.22%和58.63%。干扰BC047440基因后,肝癌HepG2细胞增殖受到明显抑制,主要停滞在s期。结论构建的shRNA能有效干扰肝癌HepG2细胞BC047440基因的表达,并抑制肝癌HepG2细胞的增殖,提示BC047440基因和肝癌HepG2细胞增殖有关。
简介:RNA干扰(RNAinterference。RNAi)是双链RNA(double—strandedRNA,dsRNA)降解特异性靶基因转录出的mRNA。从而抑制靶蛋白表达的现象。自从二十世纪九十年代发现RNAi这一现象以来,RNAi已被广泛应用于研究基因功能、信号转导通路和基因治疗等方面。随着分子生物学、分子遗传学等学科的发展.发现了许多与肿瘤发生、发展和预后密切相关的基因。经过大量临床前期试验表明,针对特异性靶基因的小干扰RNA(short/smallinterferingRNA.siRNA)治疗胶质瘤是行之有效的。为基因治疗胶质瘤提供了新的思路。
简介:摘要目的观察小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)干扰囊泡膜核苷酸转运体(vesicular nucleotide transporter,VNUT)基因对大鼠胰腺β细胞(INS-1)胰岛素分泌的影响。方法2021年1月至6月通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白印迹和酶联免疫吸附剂测定(ELISA)等方法检测siRNA对VNUT基因表达的作用以及对胰岛素分泌的影响。采用独立样本t检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果siRNA转染INS-1细胞24 h后,VNUT基因表达明显下降,对照组和干扰组RNA表达结果分别为(0.452±0.218)和(0.319±0.116),蛋白分别为(0.514±0.297)和(0.369±0.203),差异均有统计学意义(均P<0.05);胰岛素分泌明显抑制,对照组和干扰组结果为(281.45±24.92)ng/L和(176.54±15.70)ng/L,差异有统计学意义(P<0.05)。结论siRNA明显抑制VNUT基因表达与INS-1胰岛素分泌,深入研究VNUT基因对胰岛素分泌的影响可为2型糖尿病发病机制因素提供参考资料。
简介:摘要目的探讨RNA干扰Twist基因表达对肝细胞癌细胞(HCC9402)转移的抑制作用。方法用脂质体转染法将表达siRNA-Twist的真核表达载体pGenesil-1-Twist-siRNA(pTwist-siRNA)和空载体pGenesil-1-Neg-siRNA(pNeg-siRNA)导入HCC9402细胞,G418筛选阳性细胞,获得稳定转染的阳性克隆。观察siRNA-Twist对Twist表达的沉默及对肝细胞癌细胞体外侵袭转移的抑制作用,采用RT-PCR技术检测不同处理组细胞中TwistmRNA的表达水平,Western-blot测定蛋白表达水平。建立不同组裸鼠原位肝细胞肝癌模型,观察Twist沉默对裸鼠原位肝细胞肝癌转移的抑制作用。结果pTwist-siRNA组细胞内TwistmRNA及Twist蛋白的表达被有效沉默。重组细胞基底膜(Matrigel)侵袭实验显示,pTwist-siRNA组、空白对照组、pNeg-siRNA组穿透基底膜细胞数分别为(35±10)、(219±72)、(228±71)个/高倍镜(×200),前组明显低于后两组,差异分别有统计学意义(P<0.05)。裸鼠体内实验表明,pTwist-siRNA组的肿瘤转移结节、肝脏转移结节、腹水明显减少。结论RNA干扰Twist基因表达对肝细胞肝癌细胞侵袭转移有抑制作用,Twist可能成为肝细胞肝癌基因治疗的新靶点。
简介:目的:探讨转录水平基因沉默(TGS)技术和转录后水平基因沉默(PTGS)技术对肝素酶(HPA)基因干扰效果及其对肝癌SMCC-7721细胞侵袭能力的影响。方法从HPA基因启动子区和编码区分别设计并合成TGS和PTGS的小干扰RNA(siRNA),并转染肝癌细胞SMMC-7721;实时半定量PCR和Westernblotting检测TGS和PTGSsiRNA转染后48、72和96hHPA的表达,并设空白组作为对照;Transwell小室实验检测干扰后SMMC-7721细胞的侵袭能力。结果TGS和PTGS两种技术在转染48h后,从mRNA和蛋白水平上均能成功干扰HPA表达;转染后72h,PTGS组HPA恢复表达,而TGS组仍保持沉默;转染后96h,两组HPA均恢复表达。Transwell小室实验表明,TGS和PTGS组HPA基因均能使SMCC-7721的穿膜细胞数减少,TGS组效果更明显。结论TGS技术沉默肝癌SMMC-7721细胞中HPA基因的能力优于PTGS技术,并使肝癌细胞的侵袭能力显著降低。