简介:目的体外检测骨髓基质细胞分泌物对PCI2细胞的活性作用,并探讨其产生的可能机制.方法收集培养至第4代第7天的SD大鼠MSCs培养上清,按不同的体积百分比浓度加入到PC12细胞培养体系中,在倒置相差显微镜下观察1d和4d的细胞形态学改变;用丙二酸钠对PC12细胞造成氧化应激损伤,同时加入不同体积百分比浓度的MSCs培养上清,采用MTT法测定24h后的细胞活性.结果有突细胞/总细胞数、最长突起长度随培养时间及MSC培养上清体积百分比的增加而增加;PC12细胞氧化损伤后,加入一定浓度MSC培养上清组的PC12细胞活性较未加入组增高,差异有显著性.结论MSCs能够合成和分泌具有神经营养活性的物质,该物质能诱导PC12细胞分化并减轻氧化应激对PC12细胞的损伤.
简介:摘要目的观察保存温度对人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)制剂中干细胞存活率指标的影响,为干细胞制剂的保存与运输提供合理的温控建议。方法新鲜脐带取自2018年12月至2019年6月于天津华兴医院行剖宫产的健康胎儿,均由产妇自愿捐献并签署知情同意书。分离hUC-MSCs后进行培养并传代及制剂制备,之后在4 ℃、10 ℃~15 ℃、25 ℃、37 ℃温度下对细胞存活率进行测定。不同保存温度下各组间细胞存活率的比较采用t检验。结果细胞传代到第5代时,流式鉴定显示CD73、CD105和CD90阳性表达达到95%以上,CD45、CD34、CD14、CD19和人类白细胞抗原DR(HLA-DR)表达率在0~1%。细胞三向分化能力呈阳性。在25 ℃保存温度下,放置10 h时,细胞活率为86.61%,与保存在4 ℃、10 ℃~15 ℃温度比较,细胞活率下降较快(t=3.065,P<0.01)。在37 ℃保存温度下,放置4 h时,细胞活率为84.92%,细胞活率下降速度最快(t=5.178,P<0.01)。结论hUC-MSCs制剂的适宜保存温度为4 ℃~15 ℃,该温度下的最长保存时间为10 h。
简介:目的研究PBK/TOPK下调对非小细胞肺癌细胞迁移、增殖及存活能力的影响.方法选择PBK/TOPK高表达的人肺癌细胞株A549、GLC-82进行研究,实验分为干扰组和对照组.干扰组采用siRNA对两株细胞中PBK/TOPK的表达进行干扰,对照组未进行任何处理.荧光定量PCR检测siRNA对PBK/TOPK表达的影响,划痕及Transwell实验检测细胞的迁移能力,MTT实验检测细胞的增殖能力,台盼蓝染色检测细胞存活能力.分析PBK/TOPK下调对非小细胞肺癌细胞迁移、增殖及存活能力的影响.结果干扰组的PBK/TOPK表达水平明显低于对照组,差异有统计学意义(P﹤0.01);PBK/TOPK下调对非小细胞肺癌细胞迁移、增殖及存活能力有一定的抑制作用,干扰组细胞的迁移距离短于对照组,迁移数量少于对照组,OD值和存活率低于对照组,差异均有统计学意义(P﹤0.05).结论PBK/TOPK下调可明显抑制非小细胞肺癌的细胞迁移、增殖及存活能力,可应用于临床治疗,以改善非小细胞肺癌患者的治疗效果与远期生存率.
简介:摘要目的探究体外将人诱导多能干细胞(hiPSCs)定向分化成视网膜类器官(ROs)的进程并进行小鼠在体细胞移植。方法使用定向分化培养基使BC1-eGFP hiPSCs悬浮培养得到神经球,培养第7天时将神经球贴壁培养诱导出神经视网膜上皮结构,然后人工分离类视网膜结构悬浮培养,进一步定向诱导分化得到成熟的ROs。采用实时荧光定量PCR检测培养第0、7、15、21和30周标志基因的表达水平变化,采用免疫荧光染色法检测培养第8天、第15天、第15周、第21周和第30周标志基因的蛋白水平变化来鉴定诱导分化进程及效果。在体移植ROs实验中,首先破坏外界膜,然后将经消化的RO细胞悬液从角巩膜缘注射到Gnat1-/-小鼠视网膜下腔,细胞移植后5个月进行视网膜切片的免疫荧光染色检测植入细胞的存活情况、与宿主视网膜的整合以及进一步的成熟分化情况。结果形态学和免疫荧光染色结果显示,体外诱导hiPSCs早期形成的眼区细胞高表达神经视网膜上皮特异性标志物PAX6和SOX1,随后细胞可以表达视网膜祖细胞特异性标志物LHX2,集落外圈逐渐形成圆形透明马蹄状的类视网膜结构。机械分离并悬浮培养得到的ROs直径约为1 mm,类视网膜组织逐渐增厚并出现类视网膜色素上皮细胞。实时荧光定量PCR结果显示视网膜祖细胞标志基因VSX2表达在第7周即达峰值并持续高表达(F=168.30,P<0.01),视网膜前体细胞标志基因RCVRN在第7周也开始出现并逐渐高表达(F=271.60,P<0.01),感光蛋白基因RHO在第15周开始表达(F=95.02,P<0.01),而成熟感光细胞标志OPN1LW/MW的表达在第21周明显升高(F=40.57,P<0.01)。免疫荧光染色进一步检测到感光蛋白RHO在第30周达高表达状态。RO细胞移植后3周,自身带有绿色荧光的细胞成功在宿主小鼠的视网膜外核层中长期存活,移植后5个月植入细胞表达功能性光信号转导蛋白GNAT1。结论体外3D培养诱导hiPSCs生成ROs可成功地模拟人体内视网膜的发育过程,移植的RO细胞能在受体小鼠眼内长期存活,进入外核层并进一步发育成熟为类感光细胞。
简介:摘要目的探讨小鼠视神经钳夹损伤(ONC)后视网膜神经节细胞(RGCs)存活率变化。方法选取97只6~8周龄雄性C57BL/6J小鼠,按照随机数字表法分为正常组(5只)、假手术组(5只)、ONC组(87只)。正常组双眼不进行任何操作;假手术组左眼不进行任何操作,右眼行假手术操作;ONC组左眼行ONC,右眼行假手术对照。正常组分别计算左右眼RGCs密度,比较其差异;假手术组计算假手术眼RGCs密度,比较其与正常组平均RGCs密度的差异;ONC组中,以左眼(ONC眼)与右眼(假手术眼)RGCs密度的比值计算RGCs存活率,然后比较不同钳夹持续时间(5,10,20,30 s)的RGCs存活率差异(取材时间统一为钳夹后7 d),以及不同取材时间(3,4,5,7,14,30,60,90,180 d)的RGCs存活率差异(钳夹持续时间统一为20 s)。结果正常组左右眼RGCs密度分别为(5 167.3±55.6)个/mm2和(5 199.6±44.8)个/mm2,差异无统计学意义(P>0.05)。正常组与假手术组RGCs密度分别为(5 183.5±33.4)个/mm2和(5 151.5±87.6)个/mm2,差异无统计学意义(P>0.05)。ONC组不同钳夹时间(5,10,20,30 s)的RGCs存活率分别为(37.6±1.1)%、(34.0±0.9)%、(33.6±1.6)%、(30.3±0.6)%(P<0.01)。钳夹5 s与 30 s相比,ONC组小鼠RGCs存活率差异有统计学意义(P<0.01);其余不同钳夹时间相比,ONC组小鼠RGCs存活率差异均无统计学意义(P>0.05)。ONC组不同取材时间(3,4,5,7,14,30,60,90,180 d)的RGCs存活率分别为(85.4±2.0)%、(67.6±3.1)%、(43.0±1.0)%、(33.6±1.6)%、(22.7±2.0)%、(12.8±0.6)%、(10.4±0.8)%、(8.6±0.5)%、(6.7±0.2)%(P<0.01),尤其3~5 d,RGCs存活率大幅下降,30 d后RGCs存活率呈平稳下降趋势。结论在ONC小鼠模型中,不同钳夹持续时间对RGCs造成的损伤程度不同,且ONC后RGCs死亡呈进行性发展,提示在原发性损伤(钳夹)后,小鼠的RGCs经历了继发性损伤。因此,有效控制RGCs的继发性损伤,可能成为治疗视神经损伤性疾病的关键。
简介:目的:观察异丙酚对谷氨酸导致的原代培养海马细胞存活性率的影响。方法:培养12d海马神经元,随机分为正常对照组,分别加谷氨酸10umol/L,50umol/L,100umol/L再培养24h组,加谷氨酸同时加异丙酸50umol/L,500umol/L再培养24h组,MTT法测量的细胞存活率。结果:加谷氨酸对海马细胞存活率与正常组相比明显下降,谷氨酸10umol/L,50umol/L,100umol/L组存活率与正常组比下降(P<0.001),再加入异丙酚50umol/L组则存活率与加谷氨酸组没有统计学差异。再加入异丙酚500umol/L组则存活率上升(P<0.01),与加谷氨酸组有统计学差异,说明谷氨酸对神经元有毒性作用,而异丙酚对谷氨酸的细胞毒性有抑制作用,与用量呈正相关,结论:异丙酚能提高体外海马神经元的抗阻质过氧化耐力,抑制谷氨酸的神经细胞毒性作用,提高细胞的存活率。
简介:摘要目的探讨小窝蛋白1(Cav1)对棕榈酸作用下的胰岛β细胞存活的影响。方法通过慢病毒载体构建Cav1沉默的小鼠胰岛素瘤NIT-1细胞株和小鼠原代胰岛(Cav1-shRNA组),以空载体病毒组作为对照组(Ctrl-shRNA),并设空白对照组,各组均分别加入脱脂牛血清白蛋白和棕榈酸(0.5 mmol/L)处理24 h及48 h,通过四甲基偶氮唑蓝比色法及Hoechst33342/碘化丙啶(PI)双染色法检测细胞活性及细胞凋亡,实时荧光定量PCR、Western blot检测凋亡相关的mRNA及蛋白表达水平。结果采用t检验和单因素方差分析法进行统计学分析。结果与对照组比较,棕榈酸处理组的细胞存活率显著下降(0.89±0.10比0.24±0.04,t=13.49,P<0.01),P18、P19的mRNA和蛋白表达均上调(1.00±0.09比1.30±0.04、1.00±0.04比1.37±0.13,t=5.28、4.71,均P<0.05;0.87±0.04比1.48±0.05、1.02±0.06比1.41±0.07,t=16.50、7.33,均P<0.01);含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-6、Caspase-9和Caspase-12的mRNA表达水平明显上调(1.00±0.04比1.57±0.08、1.01±0.15比1.57±0.20、1.02±0.19比1.57±0.09,t=11.04、3.88、4.53,均P<0.05),蛋白表达也明显上调(0.86±0.10比1.28±0.11、0.69±0.01比0.86±0.06、0.70±0.02比1.18±0.01,t=4.89、4.84、37.18,均P<0.01)。而Cav1-shRNA+棕榈酸组细胞存活率较Ctrl-shRNA+棕榈酸组显著上升(0.53±0.10比0.26±0.08,t=4.71,P<0.01),P19的mRNA和蛋白表达均下调(1.53±0.18比0.66±0.04、1.48±0.05比0.70±0.02,t=8.17、25.09,均P<0.01);Caspase-6、Caspase-7、Caspase-9和Caspase-12的mRNA表达水平下调(1.82±0.11比1.03±0.07、1.43±0.24比0.42±0.15、1.41±0.22比0.51±0.18、1.45±0.18比0.42±0.13,t=5.48~10.49,均P<0.01),蛋白表达也下调(0.99±0.14比0.63±0.11、0.90±0.14比0.62±0.04、0.90±0.02比0.60±0.04、1.30±0.01比0.65±0.04,t=3.50~27.31,均P<0.01)。结论Cav1沉默可以通过影响胰岛β细胞Caspase家族,促进其增殖、减少棕榈酸作用下的β细胞凋亡,保护脂毒性下胰岛β细胞活性。
简介:目的观察骨髓基质干细胞(BMSCs)经局部微注射后在成年大鼠脊髓内存活、迁移及向神经细胞分化的情况。方法成年大鼠脊髓半横断后,损伤部位脊髓内注射经Hoechst标记的异体大鼠BMSCs,存活2个月后损伤部位脊髓切片观察细胞局部存活、迁移情况,同时行甲基受体蛋白-2(MAP-2)及神经胶质酸性蛋白(GFAP)免疫组织化学染色。结果注射点周围可见密集的Hoechst标记细胞存活,细胞迁移主要沿脊髓纵轴方向并跨过损伤区,迁移距离超过0.5cm,同时可见少量细胞沿水平方向迁移到注射点周围远隔部位,有少量移植细胞(少于10%)表现为MAP-2或GFAP免疫反应阳性。结论大鼠脊髓损伤后局部移植BMSCs,移植细胞可在局部良好存活、增殖,并向损伤区迁移,少量移植细胞可向神经细胞方向分化。
简介:目的:探讨αB-晶状体蛋白(αB-crystallin)高表达对人皮肤角质形成细胞(HaCaT)存活和凋亡的影响。方法:构建αB-crystallin的真核表达载体,转染至Hacarr细胞中并筛选出稳定高表达αB-crys-tallin的HaCaT细胞株,MTT法和流式细胞术分别检测高表达αB-crystallin对HaCaT细胞的细胞存活率和细胞凋亡率的影响。结果:成功筛选出高表达仅B—crystallin的HaCaT/CRYAB-1、HaCaT/CRYAB-2,该两者的αB-crystallin表达水平均较亲代HaCaT明显升高。αB-crystallin高表达的HaCaT细胞在H2O2处理后细胞存活率明显升高(t=5.23,P〈0.05),细胞凋亡率明显下降(t=15.09,P〈0.05)。结论:αB-crystallin具有促人角质形成细胞存活和抗细胞凋亡的作用。
简介:目的观察白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)、白细胞介素-12(interleukin-12,IL-12)对于纯化培养条件下视网膜神经节细胞(retinalganglioncells,RGCs)生存率的影响,进一步探讨自身免疫调节紊乱与视网膜神经节细胞损害之间的关系。方法应用抗小鼠Thy1.2抗体粘附两步纯化法,得到纯化的小鼠视网膜神经节细胞。Thy1.2单克隆抗体联合神经微管蛋白-2多克隆抗体对RGCs进行免疫细胞化学双标记法鉴定RGCs纯度。TUNEL染色法检测凋亡细胞、通过细胞形态学观察计数细胞。实验分为两个阶段,首先观察IL-4和IL-12对RGCs的直接影响;然后观察在NMDA兴奋性毒性作用下IL-4和IL-12对于RGCs的影响。结果正常培养条件下,除10U/mLIL-4外,IL-4和IL-12其余浓度组的RGC存活率均较对照组降低(P〈0.0083);当有NMDA存在时,1、10、100U/mL的IL-4和IL-12浓度组的RGCs存活率分别为79.2%、87.2%、69.5%及77.5%、76.4%和73.7%,均较单纯NMDA处理组的RGCs存活率62.25%明显提高(P〈0.0083)。结论纯化的RGCs培养条件下,IL-4和IL-12不具有直接的神经保护作用,但具有增强细胞对抗NMDA兴奋性毒性损伤的作用,提示自身免疫调节紊乱可能损伤RGCs,与青光眼等发病有关。
简介:目的探讨硫化氢(H2s)对PC12细胞存活素表达的影响及其神经保护作用.方法应用Westernblot检测不同浓度(50~800μmol/L)的H2S供体硫氢化钠(NaHS)处理PC12细胞不同时间(0~180min)诱导PC12细胞存活素表达的量效和时效关系;细胞计数Kit-8(CCK-8)比色法检测细胞的存活率.结果应用不同浓度NaHS处理PC12细胞30min后.在50~200μmol/L浓度范围内呈浓度依赖性地促进存活素表达:但随着NaHS浓度的增加,存活素表达逐渐下降,当NaHS浓度达800μmol/L时存活素表达低于正常.应用400μmo/LNariS处理PC12细胞不同时间,在0~60min时间范围内呈时间依赖性地促进PC12细胞存活素的表达,但随着处理时间的继续延长,存活索的表达逐渐下降.另一方面.400μmo/LNariS预处理还能增强氯化钴(COCl2)对存活素表达的促进作用.并可显著减轻CoCl2对PC12细胞的损伤作用,使细胞存活率增加.结论在一定浓度和时间范围内H2S可上调存活素的表达,此作用可能与其保护PC12细胞对抗化学性缺氧损伤有关.