简介:目的:构建一个牛dSl酪蛋白调控序列指导人溶菌酶(hLYZ)基因组序列的杂合基因座。方法:采用本实验室发明的连续3步缺口修复技术。将6个无痕连接的同源臂插入以pBR322为载体的骨架中,构成能进行3次连续基因抓捕的载体,利用Red同源重组系统介导的缺口修复技术,分别抓捕牛aSl酪蛋白3’端调控序列(9kb)、hLYZ基因座序列(5kb)、牛axSl酪蛋白5’端调控序列(20kb),使这3个基因片段自动无痕地连接在基因抓捕载体上,形成牛oLSl酪蛋白一hLYZ杂合基因座。结果:实验经过PCR扩增、限制性内切酶酶切验证和序列测定,验证了hLYZ的基因组序列对牛仪S1酪蛋白编码基因组序列的精确置换。结论:这种修复技术为乳腺生物反应器高效表达大载体的制备提供了可行的思路及方法。
简介:测定我国小型猪来源的猪内源性反转录病毒(PERV)3"LTR,以便于PERV全基因的克隆和分析。用cDNA末端快速扩增(RACE)技术,从五指山猪外周血淋巴细胞mRNA中扩增到PERV-3"LTR,并克隆入pGEM-Teasy载体,将阳性克隆进行序列测定和同源性分析。测序结果显示该克隆3’端的尾部有一个由12个A组成的poly(A)信号;其R区与PERV-MSL的R区(约64bp)基本一致,同源性分析表明其与PERV-MSL的3"LTR具有81%的序列同源性。说明成功扩增了我国五指山猪来源的PERV-3’LTR,将有利于PERV全基因的克隆。