简介:摘要脓毒症是宿主对感染反应失调引起的危及生命的器官功能障碍,是临床上常见的危重症。尽管对脓毒症的发病机制有了深入理解,但国内外临床治疗中脓毒症的病死率仍未见明显改善。近年来,自噬在脓毒症发病中的作用成为新的医学研究热点。自噬在脓毒症中可能通过清除病原微生物、中和微生物毒素、调节细胞因子释放等机制对机体起到保护作用,并在脓毒症时心、肺等器官功能障碍及炎症免疫反应中发挥作用。硫化氢(H2S)可通过多个信号通路激活自噬而发挥作用,如磷酸腺苷依赖性蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(AMPK/mTOR)、磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶/mTOR(PI3K/Akt/mTOR)、肝激酶B1/STE20相关衔接蛋白/小鼠蛋白25(LKB1/STRAD/MO25)和微小RNA-30c(miR-30c)等。本文就H2S通过影响自噬相关基因酵母ATG6同源物(Beclin-1)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)的表达对脓毒症肠功能的影响进行综述,以探讨H2S介导自噬相关基因表达在脓毒症肠功能损伤中的保护作用,为脓毒症治疗提供新的策略。
简介:摘要目的:研究人视网膜色素上皮(RPE)细胞光损伤中自噬与凋亡之间的关系,并探讨自噬抑制剂3甲基腺嘌呤(3MA)对光诱导下RPE细胞自噬和凋亡的影响。方法:实验研究。将体外培养的人RPE细胞(ARPE-19)随机分为12 h对照组、12 h模型组、12 h 3MA组以及24 h对照组、24 h模型组、24 h 3MA组。对照组采用锡纸包裹避光培养;模型组接受光照刺激;3MA组中加入3 mmol/ml 3MA后接受光照刺激,以自制三基色LED(发光二极管)冷光灯作为光源,在(16 500±500)lx光照强度下照射细胞12 h和24 h。透射电子显微镜观察每组细胞超微结构,流式细胞仪测定细胞存活率,激光共聚焦结合倒置荧光显微镜定性、定量分析自噬-溶酶体形态及荧光强度,Western blot法检测Beclin 1、LC3和P62自噬相关蛋白表达量。数据采用单因素方差分析。结果:在光照12 h后,ARPE-19细胞自噬水平可以抵抗光损伤,降低细胞凋亡率(F=931.53,P<0.001);光照24 h后细胞自噬水平超过其正常调节范围,细胞凋亡率升高,差异有统计学意义(F=1156.67,P<0.001);使用3MA可抑制光诱导的ARPE-19细胞过度自噬,降低细胞凋亡率(F=2.856,P=0.027),进而保护细胞以应对光损伤。结论:ARPE-19自噬水平随光照时间而变化;随着光照时间延长,细胞凋亡率升高。抑制细胞的过度自噬可以保护ARPE-19细胞应对光损伤。
简介:目的观察感染Ad5-KAI1前后人胰腺癌细胞MiaPaCa-2自噬水平的变化,并初步探讨其机制。方法应用无KAI1表达的人胰腺癌细胞MiaPaCa2,通过感染带有KAI1目的基因的复制缺陷型腺病毒Ad5-KAll使细胞表达KAll,以Ad5-null感染作为阴性对照,亲本细胞为空白对照。用透射电镜观察细胞自噬小体,共聚焦显微镜观察自噬标志LC3颗粒。应用阻断剂PD98059和LY294002干预细胞,蛋白质印迹法检测自噬相关蛋白beclin1、LC3—Ⅱ、LC3-I及ERK-1/2、磷酸化ERK-1/2(P—ERK-1/2)、AKT、P—AKT的表达。结果以100MOIAd5-KAI1感染细胞24h,表达KAI1蛋白的细胞达(84.97±8.56)%;LC3颗粒从4个左右增加到20个以上;细胞线粒体肿胀、变性,胞质内双层膜样结构增加;Beclinl表达增加(1.4±0.3)倍,LC3-Ⅱ/LC3-I表达增加(8.00±2.78)倍。P13K阻断剂LY294002预处理细胞后可以有效地抑制MiaPaCa-2细胞AKT的磷酸化(2.756降至1.516),但不能抑制LC3—Ⅱ/LC3-I比值的增加(0.770增加到1.403)。ERK阻断剂PD98059预处理细胞后不仅可以有效地抑制MiaPaCa-2细胞ERK的磷酸化(1.637降至0.403),而且可以抑制beclin1蛋白表达的上调(2.377降至1.150)和LC3.11/LC3-I比值的增加(2.225降至0.680)。结论KAIl明显促进MiaPaCa2细胞内自噬,它是通过ERK而不是AKT磷酸化途径促进自噬的。
简介:摘要目的探讨自噬相关基因在博来霉素诱导的小鼠皮肤纤维化中的表达及作用。方法(1)取72只6周龄雄性BALB/c小鼠,采用随机数字表法分为空白对照组、单纯磷酸盐缓冲液(PBS)组和博来霉素组,每组24只。空白对照组小鼠不予任何处理;单纯PBS组和博来霉素组小鼠背部皮肤分别皮下注射100 μL PBS、博来霉素(1 mg/mL),每天1次,连续注射28 d。注射7、14、21、28 d,每组分别取6只小鼠,肉眼观察小鼠背部皮肤变化,观察结束后处死小鼠,取背部皮肤组织。取注射28 d皮肤组织,行常规苏木精-伊红染色,测量皮肤组织厚度;Masson染色行皮肤组织形态学观察。取注射7、14、21、28 d皮肤组织,酶联免疫吸附测定法检测羟脯氨酸含量,实时荧光定量反转录PCR法和蛋白质印迹法分别检测p62、微管相关蛋白1轻链3 Ⅱ(LC3 Ⅱ)和Beclin-1的mRNA和蛋白表达。(2)取实验(1)中空白对照组小鼠皮肤组织,收集第3~6代成纤维细胞(Fb),采用随机数字表法分为空白对照组、单纯PBS组、博来霉素组,每组6孔。空白对照组细胞不予任何刺激,单纯PBS组、博来霉素组细胞分别加入20 μL PBS、博来霉素(1 mg/mL)刺激72 h,细胞免疫荧光染色观察LC3 Ⅱ的表达。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、t检验及Bonferroni校正。结果(1)空白对照组和单纯PBS组小鼠注射7、14、21、28 d背部皮肤菲薄、红润、静脉血管清晰,单纯PBS组从注射14 d起穿刺部位可见数个隆起的皮丘。博来霉素组小鼠注射7 d皮肤红润,穿刺点处可见数个隆起的皮丘;注射14 d,皮肤轻微变白;注射21 d,皮肤明显变白,周围血管不清晰;注射28 d,皮肤变白,周围血管无法辨认。(2)注射28 d,空白对照组与单纯PBS组小鼠皮肤组织厚度相近(t=0.79,P>0.05),博来霉素组小鼠皮肤组织厚度较空白对照组和单纯PBS组明显增加(t=0.50、0.50,P<0.01)。(3)注射28 d,空白对照组与单纯PBS组小鼠皮肤组织结构相似,均可见少量胶原,胶原排列整齐有序,毛囊分布均匀;博来霉素组小鼠皮肤胶原数目显著增多,但排列杂乱无序,毛囊数明显减少。(4)注射7、14、21、28 d,博来霉素组小鼠皮肤组织中羟脯氨酸含量明显高于空白对照组、单纯PBS组(t=0.99、0.98、0.50、0.51,0.50、0.50、0.52、0.51,P<0.05或P<0.01)。(5)注射7 d,博来霉素组小鼠皮肤组织p62的mRNA表达明显低于单纯PBS组(t=0.93,P<0.05)。注射14、21 d,博来霉素组小鼠皮肤组织p62、LC3 Ⅱ、Beclin-1的mRNA表达明显高于空白对照组(t=0.74、0.70、0.58,0.49、0.51、0.74,P<0.05)和单纯PBS组(t=0.94、0.65、0.65,0.77、0.49、0.51,P<0.05)。注射28 d,博来霉素组小鼠皮肤组织p62、Beclin-1的mRNA表达明显低于空白对照组(t=0.50、0.44,P<0.05)和单纯PBS组(t=0.97、0.55,P<0.05),而LC3 Ⅱ的mRNA表达仍显著高于空白对照组和单纯PBS组(t=0.51、0.98,P<0.01)。(6)注射7、14、21、28 d,空白对照组、单纯PBS组、博来霉素组小鼠皮肤组织LC3 Ⅱ的蛋白表达为0.167±0.042、0.122±0.016、0.553±0.078、0.118±0.035,0.120±0.023、0.117±0.061、0.581±0.039、0.159±0.065,0.233±0.027、0.304±0.031、1.020±0.010、0.089±0.045。注射14 d,博来霉素组小鼠皮肤组织p62和Beclin-1的蛋白表达明显高于空白对照组(t=0.86、0.89,P<0.05)和单纯PBS组(t=0.42、0.89, P<0.05)。注射21 d,博来霉素组小鼠皮肤组织p62、LC3 Ⅱ和Beclin-1的蛋白表达明显高于空白对照组和单纯PBS组(t=0.82、0.45、0.50,0.79、0.51、0.50,P<0.01)。注射28 d,博来霉素组小鼠皮肤组织p62、LC3 Ⅱ和Beclin-1的蛋白表达明显低于空白对照组和单纯PBS组(t=0.77、0.54、0.52,0.50、0.51、0.50,P<0.05)。(7)培养72 h,博来霉素组Fb中LC3 Ⅱ的表达明显低于空白对照组、单纯PBS组。结论博来霉素刺激皮肤纤维化过程中,自噬相关基因先升高后降低,自噬过程被激活,有望逆转皮肤纤维化进程。
简介:摘要目的探讨芪参活血颗粒含药血清对脓毒症大鼠心肌细胞(H9C2)过度自噬的抑制作用及其对脓毒症心肌细胞的保护作用。方法12只SPF级Wistar大鼠,按芪参活血颗粒低、中、高剂量[分别相当于生药12.7、25.4、50.8 g/(kg·d)]灌胃制备含药血清。将传代培养的大鼠胚胎心肌细胞(H9C2)分为五组:对照组以含10%胎牛血清的DMEM培养;脂多糖(LPS)组以含10%胎牛血清的DMEM+1 μg/ml的LPS培养;LPS+芪参活血颗粒低、中、高剂量组分别以含10%低、中、高剂量含药血清的DMEM预干预4 h后加入1 μg/ml的LPS。共同培养4 h后,应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot法检测自噬标志物Beclin-1、ATG5和LC3B的mRNA及蛋白表达;共同培育8、12、24、48 h后,采用CCK-8法检测各组细胞在不同时间点的细胞活性。结果与对照组比较,LPS组自噬标志物Beclin-1、ATG5 mRNA及Beclin-1、ATG5、LC3B蛋白表达在LPS干预细胞早期(4 h)即升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与LPS组比较,LPS+芪参活血颗粒各剂量组均可降低LPS导致的Beclin-1、ATG5、LC3B的mRNA升高及蛋白的过表达,差异有统计学意义(P<0.05)。CCK-8法检测细胞活性实验显示:LPS组及LPS+芪参活血颗粒低、中、高剂量组在12、24 h及48 h细胞活性明显下降,与对照组差异有统计学意义(P<0.05);而LPS+芪参活血颗粒中剂量组24、48 h的细胞活性较LPS组明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)。结论不同浓度芪参活血颗粒含药血清对LPS诱导的心肌细胞自噬均有抑制作用,且中剂量芪参活血颗粒灌胃大鼠获得的含药血清可通过抑制自噬改善脓毒症心肌损伤。
简介:摘要目的探讨芪参活血颗粒含药血清对脓毒症大鼠心肌细胞(H9C2)过度自噬的抑制作用及其对脓毒症心肌细胞的保护作用。方法12只SPF级Wistar大鼠,按芪参活血颗粒低、中、高剂量[分别相当于生药12.7、25.4、50.8 g/(kg·d)]灌胃制备含药血清。将传代培养的大鼠胚胎心肌细胞(H9C2)分为五组:对照组以含10%胎牛血清的DMEM培养;脂多糖(LPS)组以含10%胎牛血清的DMEM+1 μg/ml的LPS培养;LPS+芪参活血颗粒低、中、高剂量组分别以含10%低、中、高剂量含药血清的DMEM预干预4 h后加入1 μg/ml的LPS。共同培养4 h后,应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot法检测自噬标志物Beclin-1、ATG5和LC3B的mRNA及蛋白表达;共同培育8、12、24、48 h后,采用CCK-8法检测各组细胞在不同时间点的细胞活性。结果与对照组比较,LPS组自噬标志物Beclin-1、ATG5 mRNA及Beclin-1、ATG5、LC3B蛋白表达在LPS干预细胞早期(4 h)即升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与LPS组比较,LPS+芪参活血颗粒各剂量组均可降低LPS导致的Beclin-1、ATG5、LC3B的mRNA升高及蛋白的过表达,差异有统计学意义(P<0.05)。CCK-8法检测细胞活性实验显示:LPS组及LPS+芪参活血颗粒低、中、高剂量组在12、24 h及48 h细胞活性明显下降,与对照组差异有统计学意义(P<0.05);而LPS+芪参活血颗粒中剂量组24、48 h的细胞活性较LPS组明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)。结论不同浓度芪参活血颗粒含药血清对LPS诱导的心肌细胞自噬均有抑制作用,且中剂量芪参活血颗粒灌胃大鼠获得的含药血清可通过抑制自噬改善脓毒症心肌损伤。
简介:自噬是真核细胞中由溶酶体介导的自我消化的过程。根据底物降解的方式差异,自噬分为微自噬、分子伴侣介导的自噬和巨自噬三种类型。巨自噬(之后简称自噬)过程中,错误折叠的蛋白质、大分子聚合物、过剩或损伤的细胞器被称为自噬体的特殊双层囊泡吞噬。自噬体和溶酶体融合成自噬溶酶体,后者将吞噬的物质降解成氨基酸、脂肪酸、核苷酸,最后合成ATP和大分子蛋白质实现再利用[1]。基础水平的自噬通过消除未折叠、过剩或老化的蛋白以及损伤的多余的细胞器,保证细胞内成分的质量。在遇到营养剥夺、缺氧、DNA损伤、饥饿、病原体感染、内质网应激等压力时,自噬会相应地增加,这使细胞可以有效处理特定的能量状态[2]。
简介:目的研究PINK1基因对缺氧缺血性脑损伤新生小鼠细胞凋亡及细胞自噬的影响。方法将野生型和PINK1基因敲除型新生小鼠各72只分为野生型假手术组(SWT)、野生型模型组(MWT)、基因敲除假手术组(SKO)及基因敲除模型组(MKO)。模型组小鼠行右侧颈总动脉结扎后置于低氧舱中(含8%氧气和92%氮气)2.5h,假手术组不予结扎和低氧处理。缺氧缺血处理后24h,采用TTC染色法检测各组新生小鼠脑梗死程度;采用免疫组化法检测各组脑组织中活化型半胱天冬酶-3(CC3)的表达;采用TUNEL法检测细胞凋亡;采用免疫荧光法及Westernblot法检测细胞自噬相关蛋白LC3的表达。结果MKO组小鼠脑组织梗死程度较MWT组小鼠明显减轻(P〈0.05);脑组织凋亡阳性细胞数明显减少,凋亡指数降低(P〈0.05);凋亡蛋白CC3表达显著减少(P〈0.05)。MKO组小鼠自噬相关蛋白LC3表达较MWT组减少,进一步检测证实自噬指标LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值较MWT组降低(P〈0.05)。结论敲除PINK1基因对新生鼠缺血缺氧脑损伤具有神经保护作用。
简介:目的:通过构建人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)与人脐静脉内皮细胞(hUVECs)3D共培养体系,探讨自噬与血管新生的相关性。方法:使用蛋白酶和胶原酶消化法及胶原酶消化法提取hAMSCs和hUVECs。通过流式细胞仪、免疫荧光及多向分化实验鉴定hAMSCs和hUVECs。通过3D成管实验观察0、3、6、12、24、48、72hhAMSCs-hUVECs(共培养)组及hUVECs(单培养)组中hUVECs出芽的长度及面积,检测各时间点中反应自噬水平的蛋白ATG5、Beclin-1、LC3Ⅱ表达水平。结果:流式细胞仪检测发现,hAMSCs中间充质细胞表面分子标志呈阳性表达,造血干细胞及血管细胞相关的表面分子标志呈阴性表达;hUVECs中CD34呈阳性表达,CD45呈阴性表达。免疫荧光检测发现,hUVECs细胞膜上表达CD31,胞浆中表达抗血管性血友病因子(vWF)。多向分化实验证实hAMSCs具有向成骨细胞、成脂细胞及成软骨细胞分化的潜能。3D成管实验中共培养组在12h以后出芽的长度及面积均高于单培养组,共培养组ATG5表达水平在3、6h高于单培养组,共培养组Beclin-1表达水平在0、3、6h高于单培养组,共培养组LC3Ⅱ表达水平在0、3、6、12h高于单培养组。结论:本研究发现hAMSCs可以促进血管新生,并证明其促进作用与共培养体系建立早期的胞内自噬水平增高密切相关。