简介:目的探讨三七皂式单体Rgl、Rbl(三七Rgl、Rbl)在脑损伤时对脑细胞凋亡和分泌型磷脂酶A2(secretoryphospholipaseA2,sPLA2)及其相关介质的影响。方法用线栓法制成大脑中动脉缺血再灌注(middlecerebralarteryischemia-reperfusion,MCA-IR)模型,用原位末端标记(TUNEL)法检测脑细胞凋亡,用免疫组织化学法检测sPLA2在脑细胞中的表达,用^3H标记大肠杆菌膜为底物的液闪方法和酶联免疫吸附测定(ELSA)法,分别检测血清中sPLA2活性和肿瘤坏死因子。α(TNF—α)、前列腺素E2(PGE2)水平。结果在大鼠MCA-IR脑损伤时,三七Rgl、Rbl明显降低凋亡细胞数和血清中sPLA2、TNF—α。PGE2水平及sPLA2在脑细胞中的表达,与对照组相比,差异有显著性意义(P<0、01)o结论三七Rgl、Rbl对MCA—IR脑损伤有良好的保护作用,其机制在于抑制sPLA2的激活、表达及其相关介质的水平。
简介:摘要目的研究Notch1信号通路抑制剂γ-分泌酶抑制剂(DAPT)对氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠视网膜新生血管形成的抑制作用及其可能机制。方法将SPF级出生后第7天(P7)的幼鼠与C57BL/6J母鼠共同饲养于含75%氧气的氧箱中5 d,然后放回正常氧气环境下饲养,以制备OIR模型。采用随机数表法将54只OIR小鼠分为OIR组、OIR+DMSO组和OIR+DAPT组,每组18只,所有小鼠右眼作为实验眼。OIR+DAPT组和OIR+DMSO组在P14小鼠玻璃体腔内分别注射10 mmol/L DAPT和DMSO溶液1 μl,OIR组不予注射。P17时处死各组小鼠,摘出眼球后分离视网膜,采用Western blot法测定Notch1信号通路蛋白及其下游Hes1蛋白、视网膜小胶质细胞M1型标志物诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和M2型标志物精氨酸酶-1(Arg-1)蛋白的相对表达量;制备视网膜铺片,采用同工凝集素(IB4)染色视网膜血管,计算小鼠视网膜新生血管相对面积,定义为新生血管面积/视网膜总面积×100%;采用苏木素-伊红染色法观察突破视网膜内界膜的血管内皮细胞数量。结果OIR+DAPT组、OIR组和OIR+DMSO组小鼠视网膜中Notch1蛋白相对表达量分别为0.68±0.06、1.00±0.00和1.03±0.08,Hes1蛋白相对表达量分别为0.70±0.08、1.00±0.00和1.02±0.07,组间总体比较差异有统计学意义(F=70.62、53.65,均P<0.01)。OIR+DAPT组小鼠视网膜中Notch1和Hes1蛋白相对表达量均明显低于OIR组和OIR+DMSO组,差异均有统计学意义(均P<0.01)。OIR+DAPT组、OIR组和OIR+DMSO组小鼠视网膜中Arg-1蛋白相对表达量分别为1.49±0.12、1.00±0.00和0.94±0.07,iNOS蛋白相对表达量分别为0.74±0.07、1.00±0.00和1.04±0.10,组间总体比较差异均有统计学意义(F=89.32、31.63,均P<0.01),与OIR组和OIR+DMSO组比较,OIR+DAPT组小鼠视网膜中Arg-1蛋白相对表达量明显升高,iNOS蛋白相对表达量明显下降,差异均有统计学意义(均P<0.01)。OIR+DAPT组、OIR组和OIR+DMSO组小鼠视网膜新生血管相对面积分别为(8.82±2.71)%、(22.32±5.34)%和(20.27±3.36)%,突破内界膜的血管内皮细胞数分别为38.17±3.29、60.83±5.11和58.67±4.75,总体比较差异均有统计学意义(F=33.72、39.44,均P<0.01)。与OIR组和OIR+DMSO组比较,OIR+DAPT组小鼠视网膜新生血管相对面积缩小,突破视网膜内界膜的血管内皮细胞数较少,差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论玻璃体腔注射DAPT可抑制OIR小鼠视网膜新生血管形成,其作用主要是通过抑制Notch1信号通路活化,进而促使M1型视网膜小胶质细胞向M2型转化来实现。
简介:目的探讨白假丝酵母菌分泌型天冬氨酸蛋白酶(SAP)与重症婴幼儿龋(S-ECC)的相关性。方法以S-ECC患儿和无龋儿童口腔内的白假丝酵母菌临床分离菌株共40株为研究对象,分别采用YNB-BSA琼脂平板法及以牛血清白蛋白为底物配合四甲基偶氮唑盐法对比测定SAP蛋白酶活力,比较两组间SAP水平的差异;并分析SAP水平与25SrDNA基因分型的相关性。结果全部白假丝酵母菌菌株均表现为SAP蛋白酶阳性,且两种检测方法均显示S-ECC组的SAP蛋白酶水平(0.36±0.03、1.59±0.92)高于无龋组者(0.39±0.05、0.79±0.26),差异具有统计学意义(P=0.013、P〈0.001);40株白假丝酵母菌25SrDNA基因型分为A、B、C三型,B型仅在S-ECC组出现,S-ECC组白假丝酵母菌A、B、C三型的SAP蛋白酶活力间差异无统计学意义(P=0.323、P=0.492)。结论白假丝酵母菌SAP表达水平升高可能与S-ECC的进展密切相关;但其酶活力高低与25SrDNA基因分型并无明显相关性。
简介:端粒是染色体末端独特的DNA-蛋白质结构,其主要作用为保护染色体的完整性和维持细胞的复制能力.端粒酶是由RNA和蛋白质亚基构成的,能够延长端粒的一种特殊反转录酶.端粒酶激活见于大多数的人类恶性肿瘤组织中,而正常组织细胞中无端粒酶活性.因此认为端粒酶激活对于维持多数肿瘤组织细胞增殖能力是必不可少的.同时,端粒酶也成为肿瘤化学治疗的新靶点.抑制端粒酶的策略不少,用反义寡核苷酸阻断端粒酶RNA的模板作用就是一个切入点;抑制端粒酶催化蛋白亚单位则可能是抑制其活性的另一手段.另外,一些可能的端粒酶抑制剂亦已见报道,例如,核苷类似物,蛋白激酶C抑制剂,细胞分化诱导剂等.尽管不少机制尚待明确,但前景依然光明.
简介:摘要目的寻找脓毒症相关性急性肾损伤(AKI)的关键基因,为脓毒症相关性AKI的治疗提供理论和实验依据。方法①生物信息学分析:对基因表达数据库(GEO)中GSE30718和GSE53773数据集进行生物信息学分析,这两个数据集记录了肾移植手术前后对移植肾进行规律性肾活检的基因芯片数据,一部分患者在肾移植后发生了AKI。对两个数据集中AKI相关基因表达差异进行分析,找到在两个数据集中差异一致且受试者工作特征曲线下面积(AUC)较高的基因作为目的基因,进行后续细胞验证实验。②细胞验证实验:体外培养人近端肾小管上皮细胞株HK2,使用10 mg/L脂多糖(LPS)孵育6 h制备LPS-HK2细胞模型(LPS模型组),并设空白对照组;使用小干扰RNA(siRNA)技术对LPS-HK2细胞中通过生物信息学分析得出的目的基因进行敲减(基因敲减组),并设置基因阴性对照组。采用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测HK2细胞中目的基因的表达;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养液中炎症因子水平;采用蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测细胞中凋亡关键蛋白的表达。结果①生物信息学分析结果:两个数据集间有325个基因呈现相同的表达趋势,其中144个显著下调,181个显著上调,而分泌性白细胞蛋白酶抑制因子(SLPI)在两个数据集中表达差异的统计学意义均较大;进一步受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析证实,GSE30718和GSE53773数据集中SLPI表达量对AKI的诊断效能均较大,AUC分别为0.83和0.92。故选择SLPI作为目的基因进行后续细胞验证实验。②细胞验证实验结果:RT-qPCR结果显示,LPS模型组细胞中SLPI表达较空白对照组显著升高(2-ΔΔCT:1.80±0.14比1.00±0.11,P<0.01),变化趋势与生物信息学分析结果相符。进一步敲减SLPI基因分析显示,基因敲减组LPS-HK2细胞培养液中炎症因子水平较阴性对照组显著上调〔白细胞介素-6(IL-6,ng/L):509.58±27.08比253.87±75.83,IL-1β(ng/L):490.99±49.52比239.67±26.97,肿瘤坏死因子-α(TNF-α,ng/L):755.22±48.66比502.06±10.92,均P<0.01〕,说明SLPI可抑制LPS诱导的HK2细胞炎症反应;基因敲减组LPS-HK2细胞凋亡关键蛋白Bax、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)表达均较阴性对照组显著升高〔Bax蛋白(Bax/GAPDH):1.38±0.12比1.00±0.10,caspase-3蛋白(caspase-3/GAPDH):1.44±0.15比1.00±0.11,均P<0.05〕,而Bcl-2表达显著降低(Bcl-2/GAPDH:0.83±0.08比1.00±0.05,P<0.05),说明SLPI可抑制细胞在炎症反应中的凋亡。结论SLPI能抑制LPS诱导的HK2细胞炎症反应和凋亡,可能参与肾小管细胞在脓毒症反应中的保护机制,成为脓毒症相关性AKI治疗的潜在靶点。
简介:目的分别利用胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶对蜈蚣粉进行酶解并选取最佳用酶来制备抗肿瘤多肽。方法利用4种酶对蜈蚣粉进行酶解,采用MTT体外抗肿瘤实验方法,以蛋白质的水解度及酶解提取液对乳腺癌MCF-7细胞的抑制率为指标,同时以蜈蚣粉的水溶性蛋白质含量为标准,评价4种酶对蜈蚣粉的酶解效果并筛选出最佳用酶。结果胃蛋白酶对蜈蚣粉的水解度为10.44%;胰蛋白酶对蜈蚣粉的水解度为28.29%,在0.125mg·mL~(-1)及0.25mg·mL~(-1)的较小浓度下对乳腺癌MCF-7细胞的抑制率低于对照组,但随浓度的增大抑制率逐渐增大,在0.5~2mg·mL~(-1)浓度时,胰蛋白酶在4种酶中达到最大抑瘤效果;胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶的水解度分别为50.45%、44.16%,当浓度〉0.5mg·mL~(-1)时其对乳腺癌MCF-7细胞的抑制率高于对照组,在浓度为0.5mg·mL~(-1)时抑制率分别为2.86%、36.37%,且随浓度增大抑制率增大。结论蜈蚣粉酶解工艺最佳用酶为胰蛋白酶,其次是胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶,而胃蛋白酶活性较低可以去除。
简介:以糖化酶为研究对象,壳聚糖为固定化材料,采用戊二醛作为交联剂对糖化酶进行固定化,研究了戊二醛浓度、糖化酶浓度和固定化时间对固定化效果的影响,并对比了糖化酶固定化前后其酶学性质的变化。结果表明,当戊二醛浓度1%,酶添加浓度6.0g·L^-1,固定化时间12h时,糖化酶的固定化效果最好,其催化可溶性淀粉的酶活性为7125.3U’;糖化酶经过0.04g·mL^-1壳聚糖固定化后其酶学性质如催化最适温度、pH和米氏常数Km都发生了改变,分别为温度75℃、pH5.4和Km值8mg·mL^-1;固定化酶连续使用4次后,其酶活性仍保持有最初固定化时酶活性的49.82%,说明其具有一定的重复使用性。