姜黄素在人微血管内皮细胞增殖、迁移、成管以及凋亡中的作用

姜黄素在人微血管内皮细胞增殖、迁移、成管以及凋亡中的作用

刘城吴平生王月刚裴静娴赖艳娴

刘城吴平生王月刚裴静娴赖艳娴（广州市第一人民医院心血管内科广东广州510180)

【摘要】目的研究姜黄素在人微血管内皮细胞增殖、迁移、成管以及凋亡的作用，并初步探讨其机制。方法将姜黄素分为0、20、40及80μmol/L四个实验组，分别用MTS法、划痕实验、成管实验以及Hoechst33258与TUNEL双重荧光检测姜黄素对人微血管内皮细胞增殖细胞增殖、迁移、成管以及凋亡的影响。结果MTS结果显示：从姜黄素与HMVEC-Ls共同培养的第1d开始，(20-80)μmol/L三个浓度组均可抑制HMVEC-Ls增殖，与对照组(0μg/mL)相比差异有显著性(p<0.05)，尤以80μmol/L组抑制HMVEC-Ls增殖能力最显著(p<0.05)。划痕实验结果显示：(0-80)μmol/L四个姜黄素浓度组HMVEC-Ls迁移率分别为(92.33±5.01)%、(82.50±5.09)%、(63.00±5.73)%及(41.00±4.15)%，各实验组HMVEC-Ls迁移率差异有显著性(P<0.05)，其中尤以80μmol/L组HMVEC-Ls迁移率最低。成管实验。结果(0-80)μmol/L四个姜黄素浓度组HMVEC-Ls成管长度分别为(2.76±0.14)、(1.76±0.09)、(0.90±0.16)、(0.34±0.07)mm/视野，各实验组HMVEC-Ls成管长度差异有显著性(P<0.05)，其中尤以80μmol/L组HMVEC-Ls成管长度最小。Hoechst33258与TUNEL双重荧光染色。结果在姜黄素与HMVEC-Ls共同培养过程中HMVEC-Ls发生了凋亡。结论姜黄素可通过抑制人微血管内皮细胞增殖、迁移、管样形成并诱导其发生凋亡从而有效抑制肿瘤血管形成，是一种非常具有临床应用前景的抗肿瘤药物。

【关键词】姜黄素人微血管内皮细胞肿瘤性血管新生抑制

【中图分类号】R96【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）22-0130-03

Effectofcurcuminonhumanmicrovascularendothelialcellproliferation,migration,tubeformationandapoptosisinvitro

LIUcheng,WUpingsheng,WANGyuegang,PEIjingxian,LAIyanxian

【Abstract】Objective:Tostudytheeffectsofcurcuminonhumanmicrovascularendothelialcell(HMVEC-Ls)proliferation,migration,tubeformationandapoptosisinvitro.Method:TheHMVEC-Lsweretreatedwithdifferentconcentrationsofcurcumin(0,20,40and80μmol/L),andHMVEC-Lsproliferation,migration,tubeformationandapoptosiswerethenmeasuredbyMTSassay,wound-healingmigrationassay,MatrigelassayandHoechst33258/TUNELcostaining,respectively.Result:TheHMVEC-Lsproliferationmigrationandtubeformationwassuppressedbycurcumintreatment(P<0.05).Incontrast,thereweresignificantdifferencesonHMVEC-Lsproliferationattheconcentrationsof20,40and80μmol/Lcomparedwiththecontrolgroup(0μmol/L)(p<0.05).TheHMVEC-Lsmigrationratioamongthe0,20,40and80μmol/Lgroupweredeterminedtobe(92.33±5.01)%,(82.50±5.09)%,(63.00±5.73)%,and(41.00±4.15)%,respectively(p<0.05).Meanwhile,thetubelengthofHMVEC-Lsamongthefourexperimentalgroupwere(2.76±0.14),(1.76±0.09),(0.90±0.16)and(0.34±0.07)mm/field,respectively(p<0.05).Inaddition,wefoundthecharacteristicsofapoptosistreatedwithcurcuminattheconcentration80μmol/L.byHoechst33258/TUNELcostaining.Conclusion:ThesefindingssuggestthatcurcuminmayplaypivotalrolesintumorangiogenesissuppressionviatheinhibitionofHMVEC-Lsproliferation,migration,tubeformationandpromotionofapoptosis.

【Keywords】Curcumin(Cur)Humanmicrovascularendothelialcell(HMVEC-Ls)TumorangiogenesisInhibition

肿瘤内血管新生与肿瘤的生长、进展和转移有非常密切的关系，并依赖于血管生成有关的多种生长因子、细胞因子、蛋白激酶和转录因子的表达及活化，这过程被称为肿瘤性血管新生。姜黄素(Curcumin，Cur)，一种从姜黄根茎中提取得到的黄色色素，除具有抗炎、抗氧化、降血脂等多种生物学活性，目前还发现具有较强的抗肿瘤性血管新生效能，已成为国内、外抗肿瘤研究的热点。我们拟通过观察姜黄素对体外培养的人微血管内皮细胞(Humanlungmicrovascularendothelialcells，HMVEC-Ls)增殖、迁移、成管、凋亡的影响，初步探讨Cur抑制肿瘤性血管新生的机制。

1材料和方法

1.1材料

第5代人微血管内皮细胞(HMVEC-Ls)、EBM-2培养基、胎牛血清以及SingleQuots(美国Clonetics公司)，CellTiter96AssayMTS/PES试剂盒(美国Promega公司)，Growthfactor-reducedMatrigel(美国BDBioscience公司)，DNA特异性荧光染料Hoechst33258荧光染料(sigma)，末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)试剂盒(Roche)，姜黄素(sigma)，0.25%胰酶溶液(不含EDTA)/(含EDTA)(美国Gibco公司)。

1.2方法

1.2.1HMVEC-Ls透射电镜鉴定:待HMVEC-Ls细胞有90～100%融合度时，消化细胞，1000rpm×10min离心收取细胞样本；行2.5%戊二醛固定2h，1%锇酸固定2h，逐级丙酮脱水，浸透、Spurr环氧树脂包埋，70℃聚合20h。切片机超薄切片，片厚100nm。常规饱和醋酸铀、1％柠檬酸铅染色后，JEM1200-EX透射电镜观察。

1.2.2细胞增殖评价：96孔板中以5000个细胞/孔的密度铺板。8h后换成EBM-2培养基(不含SingleQuots)维持24h，将姜黄素用EBM-2培养基(含SingleQuots)进行不同浓度梯度的倍比稀释后每孔加入100μL，使终浓度分别为0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL，种植在96孔培养板中，每组实验重复6次,每一组每次为12个孔,分别于接种后的第1、3、5、7天应用MTS/PES试剂盒测细胞增殖率。在Bio-Rad550型Microplatereader于490nm波长处测量吸光度,细胞生长率用吸光度(x-±S)来表示。

1.2.3划痕实验：将HMVEC-Ls以1.0×104cells/皿的密度接种于35mm培养皿内，并置于37℃5%CO2饱和湿度培养箱内培养48-72h以形成完全融合的单细胞层，于白纸上每隔3mm划平行线，将完全融合的HMVEC-L培养皿置于其上，使用200ul无菌吸头沿线将皿内完全融合的HMVEC-L单细胞层划伤，然后用PBS轻轻洗去脱落细胞碎片，用分别含有0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL姜黄素的EBM-2培养基(不含FBS和SingleQuots)并置于37℃5％CO2饱和湿度中继续培养，于12小时后拍照并使用图像分析软件IPP6.1分析。细胞迁移能力以迁移率表示【细胞迁移率(%)＝(原划痕面积－残留面积)/原划痕面积×100%】。

1.2.4成管实验：将HMVEC-Ls以1.0×104cells/孔的密度接种于预先由Matrigel基质胶(BD公司)包被的96孔板中并置于37℃5%CO2孵箱中培养，待细胞帖壁后，立即更换为含有0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL姜黄素的EBM-2培养基(不含FBS和SingleQuots)继续培养，于8h后在光学显微镜下观察管样结构并用图像分析软件IPP6.1分析。

1.2.5细胞凋亡的Hoechst33258与TUNEL双重荧光染色

制备对数生长期的HMVEC-Ls细胞悬液，以105/孔的密度加入六孔板。加入3mL含有80μg/mLCur的EBM-2培养基(含SingleQuots)，继续培养7d，4%多聚甲醛固定60min，PBS漂洗，加入1mL含0.1%TritonX-100和0.1%柠檬酸钠的穿透液，冰上孵育2min；PBS漂洗，加入50μL含荧光素标记的dUTP和TdT的反应液，37℃暗室中湿盒孵育60min；PBS漂洗3次，每孔加入0.5mL5μL/mLHoechst33258染色液染色10min；PBS漂洗后，在倒置荧光显微镜下，绿光波长处观察TUNEL染色情况，紫外光波长处观察Hoechst33258染色情况并拍照。

1.3统计学方法用SPSS15.0统计软件,采用OneWay-ANOVA方差分析，方差齐性时组间比较采用LSD法，方差不齐时组间比较采用Games-Howell检验。

2结果

2.1HMVEC-L细胞形态学观察：倒置相差显微镜下观察见培养的HMVEC-Ls呈“铺路石”样排列(图1A)，细胞为扁平多角形，边界清楚，胞浆丰富；电镜下见吞饮小泡和内皮细胞特有的Weibel-Palade小体(W-P小体，图1B)，其横切面呈圆形或椭圆形，纵切面呈杆状，可见小管状结构，证实培养的细胞为内皮细胞。

图3姜黄素诱导HMVEC-Ls凋亡的双重荧光染色

A：Hoechst33258染色(×40)B：TUNEL染色(×40)

3讨论

血管新生是机体对组织缺氧的一个适应性反应，在一系列的生理和病理过程中发挥重要作用，如：胚胎发育、伤口愈合，炎症，肿瘤生长和血管瘤的形成等[1]。姜黄素作为从姜黄根茎中提取的一种植物多酚，目前已被证明对多种人类癌症有良好的抗癌性能，其机制可能与抑制肿瘤血管新生、诱导肿瘤细胞凋亡、阻断肿瘤细胞的生长信号传导通路及抑制黏附分子的表达有关[2]，其中抑制肿瘤血管新生可能是其抗肿瘤治疗的核心机制[3]。更进一步的，血管内皮细胞作为血管新生的主要靶细胞，我们并不十分清楚姜黄素如何通过改变血管内皮细胞的生物学特性来抑制肿瘤血管新生？血管生成是一个复杂的过程，涉及血管内皮细胞的活化、增殖、迁移、管样以及毛细血管发芽等过程[4]。因此，我们亦选择了相关实验来评估不同浓度的姜黄素处理HMVEC-Ls后的细胞血管新生特性变化。结果显示：(1)在不同浓度的Cur与HMVEC-Ls共同培养1、3、5、7d过程中，从培养的第1d开始(20-80)μmol/L浓度组均可抑制HMVEC-Ls增殖且具有浓度依赖性。从培养的第3d开始80μmol/L姜黄素组抑制HMVEC-Ls增殖的能力较其它组显著增强，直至第7d时抑制率约高达45%，且此时HMVEC-Ls出现明显的细胞变圆，染色质凝聚、分块，胞质皱缩。(2)迁移及成管实验表明，Cur能够明显抑制HMVEC-Ls后迁移及成管，随着Cur浓度的增加而抑制能能亦明显增强，且同样表现出浓度依赖性的特点。(3)我们对增殖实验中(20-80)μmol/L姜黄素组出现的HMVEC-Ls细胞不同程度变圆、染色质凝聚、胞质皱缩现象进一步通过TUNEL与Hoechst33258双重荧光染色鉴定为发生了凋亡现象，说明高浓度姜黄素对HMVEC-Ls的促凋亡作用明显。这些数据表明：姜黄素具有较强的抗肿瘤内血管新生的能力，可作为一种具有良好发展前景的抗肿瘤药物。

血管新生与肿瘤细胞的生长和转移的密切相关，抑制血管生成从而达到抗肿瘤转移已成为新的肿瘤治疗策略。肿瘤性血管新生是一个非常复杂的过程，低氧诱导因子-1α(hypoxiainduciblefactor1，HIF-1α)作为一个重要的核转录因子，能调节众多的HIF-1α诱导的促血管新生基因参与血管新生过程，具有“总开关”的特点，是肿瘤性血管新生的中心环节[5]。姜黄素能下调HIF-1α的表达并抑制HIF-1α的转录活性致使HIF-1α诱导的VEGF等靶向血管生长因子的表达减少，从而在肿瘤抑制中起重要作用[2]。同时，姜黄素可通过抑制VEGF受体表达来抑制实体肿瘤内血管新生，进一步说明姜黄素是一种特异性血管新生抑制剂[6]。其次，姜黄素还通过对参与血管形成的蛋白水解酶(如：MMP家族和尿激酶纤维蛋白酶原激活剂家族[7])发挥抑制效应以及破坏新生血管的成熟度来抑制血管新生[8]。再次，姜黄素能下调黏附分子(如：ICAM21、VCAM21、ELAM21等)的表达抑制肿瘤细胞转移[9]。最后，姜黄素能诱导血管内皮细胞凋亡来发挥抗血管新生作用[10]。其机制可能与调节转录因子AP-1、NF-κB、Akt以及MAPK信号通路密切相关[11-13]。

抗肿瘤血管新生研究已进行了40年，最初认为机体内所有内皮细胞都是均质的，但现在普遍认为内皮细胞随血管树高度的不同为更好适应局部微环境表现出不同的异质性。内皮细胞之间这种异质性以及局部微环境的特异性使得在进行体内、外血管新生研究时靶细胞的选择变得更加复杂化，如，正常与肿瘤血管之间[14]。血管新生通常涉及的是微血管的新生而不是大血管，以动脉环法为代表的相关体内血管新生研究结果并不理想[15]，亦证实了血管新生是一个微血管新生的过程。因此，必须根据所研究的血管疾病来选择最接近的实(试)验条件和细胞类型，故本研究中我们选用HMVEC-Ls作为我们体外抗肿瘤性血管新生研究的靶细胞。

综上所述，肿瘤的生长、进展和转移的核心关节是肿瘤性血管新生，姜黄素可通过抑制血管内皮细胞的活化、增殖、迁移、管样形成并诱导其发生凋亡从而有效抑制肿瘤血管形成，成为最有临床应用潜能的新型抗肿瘤药物。

参考文献

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基金项目：国家自然科学基金(编号:81100235)

广东省自然科学基金(编号：S2011040004458)

广州市医药卫生科技项目资助(编号:20121A011006)