补肺胶囊的微生物限度检查法的验证试验

补肺胶囊的微生物限度检查法的验证试验

蒋玲韩云霞

蒋玲韩云霞（贵州贵阳中医学院第二附属医院药剂科550001）

【摘要】目的建立补肺胶囊的微生物限度检查方法。方法采用常规法、培养基稀释法对补肺胶囊的细菌、霉菌及酵母菌计数测定进行加样回收率试验。结果采用培养基稀释法（1:10供试液，0.5ml/皿）能有效消除补肺胶囊的抑菌作用，使三个批号样品的金黄色葡萄球菌的加样回收率均大于70%；采用常规法能使三个批号样品的大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌及黑曲霉的加样回收率均大于70%。结论因补肺胶囊对金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用，所以其微生物限度检查采用培养基稀释法进行细菌计数；采用常规法进行霉菌和酵母菌计数；采用控制菌中大肠埃希菌的相应检查法进行其控制菌的检查。

【关键词】补肺胶囊微生物限度检查方法学验证培养基稀释法

补肺胶囊为我院自主开发的中药成方院内制剂，临床上主要用于慢性阻塞性肺疾病、慢性肺心病的治疗，对肺肾虚弱引起的头晕耳鸣，口干咽热，五心烦热，潮热盗汗，咳嗽咯痰等症疗效显著。其主要成分由土炒白术、补骨脂、醋南五味子、炙甘草等多味中药组成。根据《中国药典》（2010年版）一部制剂通则项下规定，应进行药品微生物限度检查，并且所用方法应通过方法学验证的要求[1]，为此，依据制剂自身和生产工艺的特性，通过本实验为补肺胶囊建立适宜的微生物限度检查方法。本实验的供试品均为我院中药制剂室生产提供，同属性较强，由于验证实验的根本目的是为了确证样品的前处理过程是否有效地去除了其抑菌活性，根据类同试验，故预试验只取一个批号的样品，并增加两个稀释级做试验。另取三个批号做方法学的重现性验证。

1仪器与材料

1.1仪器标准型净化工作台（苏州净化设备厂CW-cj-1B）、恒温培养箱（上海市跃进医疗器械一厂HH-Bll420）、生化培养箱（广东省医疗器械厂LRH-250A）、电冰箱（青岛海尔电冰柜有限公司LC-160）、高压蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂YXQ-280）、显微镜（中国南京光学仪器厂XSP-16A）、架盘天平（北京医用天平厂HC、TP12A）、恒温水浴锅（DZKW-4型）、三用紫外分析仪（上海宝山顾村光电仪器厂）。

1.2标准菌种金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）[CMCC(B)26003]；大肠埃希菌（EscherichiaColi）[CMCC(B)44102]；枯草杆菌（BacillusSulticis）[CMCC(B)63501]；白色念珠菌（Candidaalbicans）[CMCC(F)98001]；黑曲霉菌（Aspeigillusniger）[CMCC(F)98003]，本实验所用菌种均为第三代，由中国药品生物制品检定所提供。

1.3试剂及试液营养肉汤培养基（批号：110126）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号：090521）、营养琼脂培养基（批号：090414）、改良马丁培养基（批号：090121）、胆盐乳糖培养基（批号：091203）、4-甲基伞形酮葡萄糖昔酸培养基（批号：101020）、pH7.0无菌氯化钠-蛋白陈缓冲液培养基（批号：110328），以上培养基均由北京三药科技开发公司生产，均按《中国药典》2010版规定配制及灭菌。0.9%无菌氯化钠（四川科伦药业，批号：111006）；另外，靛基质试液自配。

1.4供试品补肺胶囊(由贵阳中医学院第二附属医院药剂科中药制剂室提供，批号：20111118、20120201、20120202、20120203)。

2方法与结果

2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证

2.1.1菌液制备取经37℃培养18-24h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌营养肉汤新鲜培养物分别用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml含50-100cfu的菌悬液备用。取经25℃培养18-24h的白色念珠菌改良马丁新鲜培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml含50-100cfu的菌悬液备用。取经25℃培养1周的黑曲霉菌斜面培养物，加0.9%无菌氯化钠溶液3-5ml洗下霉菌孢子，吸取菌悬液，用0.9%无菌氯化钠溶液，逐级稀释并制备成每1ml含50-100cfu的菌悬液备用。

2.1.2供试品溶液的制备称取样品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白陈缓冲液100ml使浓度成1:10供试液。

2.1.3方法验证预试验[2]

2.1.3.1常规法取1:10的供试液1ml分别加人相应阳性对照菌各50-100cfu，立即注入相应培养基15-20ml，待培养基凝固后，置规定的温度下倒置培养。大肠埃希菌、枯草芽抱杆菌和金黄色葡萄球菌培养24-48h，白色念珠菌和黑曲霉菌培养48-72h。

2.1.3.2培养基稀释法取l:10的供试液0.5ml分注4个皿，0.2ml分注10个皿，加人金黄色葡萄球菌50-100cfu，注人营养琼脂培养基15-20ml，待培养基凝固后，置规定的温度下倒置培养24-48h。

2.1.4方法验证预试验结果以上预试验的回收率结果见表一。

表一敏感菌株预试验回收率结果（%）

备注：“——”标示未做。

试验结果显示，常规法中大肠埃希菌、枯草芽抱杆菌、白色念珠菌和黑曲霉菌的回收率，均大于70%，表明补肺胶囊对相应阳性菌没有明显抑制作用；但是金黄色葡萄球菌的回收率小于70%，表明补肺胶囊对金黄色葡萄球菌的抑制作用明显。采用培养基稀释法（0.5ml/皿、0.2ml/皿）均能有效消除补肺胶囊对金黄色葡萄球菌的抑制作用；综合考虑实际工作中的可操作性及经济因素，因此确定补肺胶囊的细菌计数方法为培养基稀释法（1:10供试液，0.5ml/皿，分注4个皿），而霉菌及酵母菌的计数方法为常规法。

2.1.5细菌数、霉菌和酵母菌数测定方法的验证取三批补肺胶囊样品，细菌按培养基稀释法（1:10供试液，0.5ml/皿，分注4个皿）进行加菌回收率试验，霉菌及酵母菌按常规法进行加菌回收率试验，结果见表二。

表二三批补肺胶囊回收率试验结果(%)

2.2控制菌检查方法验证

2.2.1大肠埃希菌检查方法验证结果见表三。

①试验组：取1:10供试液10ml接种至100ml胆盐乳糖培养基（BL）中，同时加人大肠埃希菌50~100cfu，35℃培养18~24h。取培养物0.2ml接种至5mlMUG培养基的试管中，35℃培养24h左右，在366nm紫外灯光下观察荧光，然后再进行靛基质试验。另取培养物在麦康凯琼脂培养基平板上划线，35℃培养18~24h，观察其菌落形态。

②阴性菌对照组：取金黄色葡萄球菌作为阴性对照试验菌，方法同试验组。

③空白对照组：取未接种的MUG培养基试管作为空白对照组。

表三大肠埃希菌检查方法的验证试验结果

备注：“+”标示MUG呈现荧光反应或靛基质呈现枚红色反应；

“—”标示MUG未呈现荧光反应或靛基质呈现试剂本色反应；

“——”标示未做此项。

3讨论

具有抑菌性药物的微生物限度检查结果的准确性，主要取决于样品本身在试验条件下是否抑制被检微生物的生长繁殖。检验时应排除其抑制作用，使之不干扰染菌限度检验，结果方属有效。本实验通过预试验，采用排除法确认方法的适应性。三批样品的验证试验结果表明，采用培养基稀释法（1:10供试液，0.5ml/皿，分注4个皿）对补肺胶囊进行细菌计数，三种规定试验菌的回收率均大于70%，并且操作简便易行，更为客观符合《中国药典》2010年版一部附录XIIIC微生物限度检查法的规定，方法可行。采用常规法进行霉菌及酵母菌的计数，两种规定试验菌的回收率均大于70%，方法可行。控制菌方法验证试验结果表明，采用常规法检查补肺胶囊中的大肠埃希菌，方法可行。

参考文献

[1]中国药典.2010.一部附录:79-88.

[2]宋高文,黎强,庞兴寿,等.咳特灵胶囊微生物限度检查方法的验证.中国药师,2005;11(21):1379-1380.