假肥大型进行性肌营养不良基因诊断研究进展

假肥大型进行性肌营养不良基因诊断研究进展

梅燕 1 综述 严提珍 2,3 审校 王远流通讯作者

1 柳州市妇幼保健院围产期保健科 广西科技大学附属妇产医院、儿童医院 广西 柳州 545001 2 柳州市出生缺陷预防与控制重点实验室 广西柳州 545001 3 柳州市妇幼保健院医学遗传科 广西柳州 545001

【摘要】 假肥大型进行性肌营养不良是一种X-连锁隐性遗传性肌病，临床以进行性加重的对称性肌无力、肌萎缩，血清肌酸激酶水平增高，腓肠肌假性肥大为主要特征，临床病情轻重不一。致病基因为编码抗肌萎缩蛋白（dystrophin）基因，该基因组序列跨越2200 kb，由79个外显子组成，是迄今发现的最大的人类基因。DMD基因突变类型复杂多样，包括单个或多个外显子缺失、基因片段重复、单个碱基互换、缺失或插入。迄今已形成多种检测技术，从Sanger测序、多重-PCR、Southern杂交到多重连接探针依赖扩增技术（Multiplex Ligation probe amplification，MLPA）、单个扩增/内部引物测序技术（single condition amplification / internal primer sequencing technique，SCAIP）、基于基因芯片的比较基因组杂交（array-based comparative genomic hybridization，aCGH）、新一代测序技术（next-generation sequencing，NGS）等，检测方法优缺点各异，本文结合DMD/BMD临床表现和分子遗传学检测手段就DMD/BMD的分子遗传学诊断策略进行综述，以期形成完整全面的临床诊断思路。

【关键词】肌营养不良；DMD基因；诊断

1 DMD/BMD先证者诊断

1.1 大片段的缺失/重复突变检测

据报道DMD基因的大片段缺失突变约占DMD的65%，占BMD的85%，大片段重复突变占DMD/BMD 6%-10%，多重-PCR法是检测DMD基因缺失突变最常用的方法，但不能完全检测DMD基因79个外显子所包括的区域，而且不能检出重复突变，还需要严格控制实验条件，否则极易出现假阳性、假阴性结果。Southern杂交尽管能检出较大片段的缺失/重复突变以及部分女性携带者，但具有灵敏度较低、费时、需要有害试剂等缺点。

1.2 点突变检测

DMD基因点突变占DMD 25%-35%，占BMD 10%-20%。Francesca等应用直接测序方法对41例（35例DMD，6例BMD）假肥大型肌营养不良患者检测，发现40例与临床表型相关的不同的DMD基因核苷酸改变，其中16例为新发突变，DMD患者中9例为微缺失/微重复，19例为无义突变，7例为剪接突变，BMD患者中2例为无义突变，2例为剪接突变，1例为错义突变，1例为单个碱基插入，而且还发现最常见的终止密码子是TGA，其次是TAG、TAA。

1.3 临床表型判断

若致病DMD基因突变已检出，在某些病例中却很难判断是DMD还是BMD，例如，外显子3-7缺失，在男性DMD和BMD患者中都是最常见的缺失突变，因此需要结合患者临床表现及相关实验室检查等确诊。

1.4 相似病例鉴别

若没有致病DMD基因突变检出，而肌肉活检却支持DMD/BMD诊断，那么需要进一步行Western blot和免疫组化检测抗肌萎缩蛋白。由于DMD/BMD表型与部分肢带肌肉萎缩（LGMDs）如LGMD2I相似，为避免损伤有必要在肌肉活检之前行分子遗传学检测确诊。

2 DMD男性患者与X-连锁遗传性疾病鉴别诊断

DMD基因邻近基因缺失突变引起的其他类型X连锁性疾病包括慢性肉芽肿病、色素性视网膜炎、肾上腺发育不全和甘油激酶缺乏症等。邻近基因缺失突变的确诊通过染色体微阵列（CMA）检测，发现位于Xp21.2上的基因缺失，或通过FISH分析联合探针检测（包含DMD外显子上GK和NROB1的探针）发现Xp21.2上的基因重排，以达到在分子水平上鉴别DMD男性患者和单个或多个X-连锁遗传性疾病的目的。

3 典型DMD女性患者诊断

尽管DMD/BMD是一种X染色体隐性遗传性疾病，近年来有女性患者的报告^[9,10]，女性患者的发病机制可能为Xp21.2上的单个基因缺失突变、染色体基因重排或全部缺失、单亲二倍体、两种DMD基因突变的复杂杂合突变、非随机性的X染色体失活（XCI）等。Soltanzadeh等对15例具有典型DMD表现的女性患者联合应用SCAIP、MLPA技术检测DMD基因突变，发现8例为外显子缺失/重复突变，6例为点突变，其中1例为2种突变（单个外显子缺失和单个剪接位点突变），该结果进一步提高了有典型DMD症状的携带者的诊断率，并扩大了

DMD基因杂合突变的突变谱。

4 携带者确认

4.1 当先证者DMD突变明确后，若突变为单个基因的缺失/重复，所有用于先证者缺失/重复突变检测的方法均可用于携带者的检测。Zeng等应用MLPA 技术，以覆盖全部外显子和启动子区域的124个探针一次性检测了患者所有DMD基因缺失和重复突变，并可鉴定携带者^[1]。

4.2 当先证者DMD基因突变未知，且女性携带者亦未检出DMD突变时，可应用连锁分析法以明确诊断，并进一步明确家族成员中的遗传关系。

5 新发突变检测

家族中只有一人患肌萎缩性疾病，可通过缺失/重复分析法或测序法联合连锁分析检测。患者的单体型DMD等位基因突变可追溯到母亲，必要时，可通过母系祖辈确诊突变基因来源。基因突变扫描方法如变性高效液相色谱分析或单个扩充内部引物测序方法（SCAIP）、高分辨率解离曲线分析都能检测单个碱基的改变，且价格较合理。SCAIP技术可检出所有类型的点突变，包括终止密码子、小的缺失和插入、剪接位突变。操作上首先应用PCR技术扩增分离的基因区，然后直接应用标准自动化基因测序技术检测点突变和其他类型突变。

6 基因突变同时检测

目前，多数实验室采用的技术手段多局限在检出DMD基因大片段缺失/重复突变，或微小突变，若采用Sanger法直接测序^[2]，需付出大量的人力、物力和时间。近年新发展的新一代测序技术（next-generation sequencing，NGS）一般先应用靶向富集技术捕获基因组的外显子区域，再通过高通量测序获得编码区序列，进而发现疾病遗传特征，在一定程度上解决了杂交芯片和传统测序技术的局限性，相对成本低，可以详细分析编码区的遗传变异^[3]。NGS技术实现了高准确、高通量、高灵敏度的基因检测，并能在一次实验中完成各种类型突变检测，且运行成本低。^【4】综上所述，DMD/BMD可依据进行性肌无力^[5]、血清CK显著升高，肌电图呈肌病表现建立临床诊断，但确诊需要进行突变基因分析。DMD基因庞大，突变发生率高，突变类型多样，目前，联合2种或2种以上检测技术确定大片段缺失/重复、微重排、点突变以及携带者是分子诊断的主要策略。点突变检测依赖于Sanger测序；MLPA和多重PCR检测大片段的缺失/重复突变以及携带者筛查；aCGH平台用于检测DMD基因拷贝数变化并定位断裂点（breakpoint），具有更高的分辨率和灵敏度^[6]，但不能辨认平衡易位；具有典型DMD表现的女性患者可联合应用SCAIP、MLPA技术；应用新一代测序在同一个平台检测DMD所有突变，节省检测时间和费用，具有广泛的应用前景。

参考文献

1. 刘敏娟，谢敏，毛君，等．第二代测序技术在假肥大型肌营养不良基因诊断中的应用[J]．中华医学遗传学杂志，2012，29(3)：249-254．

[2]杜娟,刘星鹭,陈诚,左江成.Duchenne型肌营养不良1例诊断体会[J].国际检验医学杂志,2020,41(3):380-381.

[3]高伟芳,陈蓓蕾,朱艳.强直性肌营养不良1例报告[J].中风与神经疾病杂志,2020,37(1):68-69.

[4]吕雪,李昊,刘红彦,侴海燕,李涛,周武.COL7A1基因复合杂合变异所致的隐性营养不良型大疱性表皮松解症家系的遗传学分析[J].中华医学遗传学杂志,2020,37(4):445-448.

[5]徐敏,郭虎,高修成,卢孝鹏.肢带型肌营养不良2D型1例临床与基因型分析[J].临床儿科杂志,2020,38(2):113-115,119.

[6]陈巍,刘敬花,毛羽,彭晓燕.RP1L1基因突变所致黄斑营养不良一例[J].中华眼底病杂志,2020,36(3):229-231.

作者简介     姓名：1、性别：女       2、出生年月（具体到月份）：1978.06.02       3、民族：汉       4、籍贯（需具体到市/县）湖北钟祥市       5、学历：硕士研究生       6、职称：副主任医师       7、职务：无       8、研究方向 ：产前诊断       9、单位：柳州市妇幼保健院围产保健科       10、邮编：545000 11，单位级别 ：三甲 通讯作者王远流，柳州市妇幼保健院围产保健科   主任医师

基金项目：广西壮族自治区卫生和计划生育委员会自筹经费科研课题（编号：Z2016542）