参蛭活血汤对膜性肾病大鼠抗炎和抗氧化作用

参蛭活血汤对膜性肾病大鼠抗炎和抗氧化作用

王新伟,伊世华,程广红,巩昭勇,隋淑梅

（哈尔滨香坊区三辅街142号 黑龙江省中医药科学院 150036 第一作者：王新伟）

摘要：目的：探讨参蛭活血汤对膜性肾病大鼠抗炎和抗氧化作用。方法：采用C-BSA与弗氏不完全佐剂制造膜性肾病大鼠模型，随机分为6组：空白组、模型组、雷公藤组、参蛭活血汤高中低剂量组。在正式免疫第3周检测大鼠24小时尿蛋白后按上述各组分别给药4周后处死大鼠，检测各组大鼠血肌酐、尿素氮、采用酶联免疫法测定各组肾脏组织中炎性因子IL-2、IL-6和TNF-a的含量，测定各组肾组织中丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）含量。结果：与空白组比较，模型组24h尿蛋白、血肌酐、血尿素氮显著升高（P<0.05），肾组织中 IL-2、IL-6和TNF-a蛋白表达增加（P<0.05），MDA 表达增加（P<0.05），SOD表达减少（P<0.05）；与模型组比较，中药高中低组治疗后24h尿蛋白、血肌酐、血尿素氮明显降低（P<0.05），肾组织中IL-2、IL-6和TNF-a蛋白表达减少（P<0.05），MDA表达减少（P<0.05），SOD表达增加（P<0.05），且高剂量组效果最佳。结论：参蛭活血汤通过抑制氧化应急反应从而降低炎性因子表达最终降低尿蛋白、血肌酐、尿素氮等肾病标记物从而改善肾功能等肾脏保护作用。

关键词: 参蛭活血汤；膜性肾病；氧化应激；炎性因子

Anti-inflammatory and antioxidant effects of Shenzhihuoxue decoction on rats with membranous nephropathy Objective: To explore the anti-inflammatory and antioxidant effects of Shenzhi Huoxue decoction on rats with membranous nephropathy. Methods: A rat model of membranous nephropathy was made by using C-BSA and Freund's incomplete adjuvant, and randomly pided into five groups: blank group, model group and high, medium and low dose group of Shenzhi Huoxue decoction. After the 24-hour urine protein was detected in the third week of formal immunization, the rats were killed after four weeks of administration according to the above groups. The serum creatinine and urea nitrogen of rats in each group were detected. The contents of inflammatory factors IL-2, IL-6 and TNF-a in kidney tissues of each group were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and the contents of malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD) in kidney tissues of each group were determined. Results: Compared with the blank group, the 24-hour urine protein, serum creatinine and blood urea nitrogen in the model group increased significantly (P < 0.05), and the expressions of IL-2, IL-6 and TNF-a protein in renal tissue increased (P < 0.05), MDA increased (P < 0.05) and SOD decreased (P < 0.05). Compared with the model group, the urine protein, serum creatinine and blood urea nitrogen in the middle, high and low groups of Chinese medicine decreased significantly (P < 0.05), and the expressions of IL-2, IL-6 and TNF-a in kidney tissue decreased (P < 0.05), MDA decreased (P < 0.05) and SOD increased (P < 0.05). Conclusion In this rat model, conclusion: Shenzhi Huoxue decoction can reduce the level of systemic oxidative stress by inhibiting oxidative emergency response, thus reducing the expression of inflammatory factors and ultimately reducing urinary protein and improving renal function. Key words: Shenzhi Huoxue decoction; Membranous nephropathy; Oxidative stress; Inflammatory factor

引言

参蛭活血汤是黑龙江省中医医院肾三科主任王新伟教授在广泛查阅文献，总结历代医家经验的基础上，反复遴选，精简药味而成，并应用临床多年，疗效确切，能够有效减少蛋白尿，延缓肾脏病进展，提高患者生存质量，但潜在的分子机制尚未完全了解，前期研究发现参蛭活血汤可以治疗肾炎可减轻炎症反应，减少尿蛋白[1]。

膜性肾病(MN)是常见成人肾病综合征一种[2]。膜性肾病的病理诊断表现为肾小球基底膜弥漫性增厚，以及IgG和补体在肾小球毛细血管环周围的颗粒沉积[3]。越来越多研究表明，中药已被用于治疗各种类型的慢性肾脏病[4]。在临床上，参蛭活血汤主要用于治疗膜性肾病降低蛋白尿、缓解肾功能障碍、抑制肾小球细胞增殖和肾间质纤维化[5，6]。因此，抑制肾病的炎性因子激活与抗氧化可能治疗膜性肾病关键方法。生理条件下活性氧(ROS)在细胞功能的中起着重要的信息传输作用。然而过量ROS产生将作为不良反应的介质：例如炎症、坏死和凋亡。在肾病中活性氧是肾损伤的重要原因。另据报道由活性氧增加和减少引起的肾衰竭及抗氧化酶可以通过抗氧化疗法来治疗肾病的方法[7,8]。在本研究中，我们通过膜性肾病大鼠研究参蛭活血汤的抗炎和抗氧化作用，探讨参蛭活血汤对肾脏的保护作用。

1材料与方法

1.1实验材料与动物

中药购哈尔滨医科大学实验动物学部，弗氏不完全佐剂购自美国Sigma公司，大鼠白细胞介素IL-2、白细胞介素IL-6和肿瘤坏死因子TNF-α酶联免疫试剂盒购于江苏绿叶生物科技有限公司，ROS、SOD和MDA购于英国南京建成公司。

1.2参蛭活血汤制备

参蛭活血汤组成有黄芪50g、水蛭15g、党参20g、桃仁15g、红花15g、赤芍15g、麦冬10g、当归15g、生地15g、莲子10g、地骨皮10g、甘草10g。药物制备：药物饮片同批次采购自黑龙江省中医医院，由煎药室将以上药物每付煎煮浓缩至400ml，弃去滤渣，合并滤液，过滤，水浴锅将药物浓缩为3.4g/mL，备用。

1.3膜性肾病大鼠模型建立及分组

应用C-BSA1mg，加入0.5mlPBS中与等量的弗氏不完全佐剂混匀成乳白色悬液，在大鼠双侧腋下、腹股沟作多点皮下注射。预免疫1周后，每次每只大鼠尾静脉注射C-BSA2.5mg（溶于1ml pH7.4 PBS中），每周3次，共3周。造模结束后经检测大鼠24h尿蛋白显示造模成功，临床成人用量为170g/d，大鼠给药剂量均根据《中药药理实验方法学》中的临床等效剂量估算法，应用人与大鼠的体表面积折算的等效剂量比值（1:0.018）进行换算，换算后大鼠用量为26.1g/kg·d，予双倍剂量g/kg·d灌胃处理。随后分组将雄性SD大鼠随机分为空白组、模型组、雷公藤组按（8.1g/kg/d）、参蛭活血汤高（104.4g/kg）、中（52.2g/kg）、低（26.1g/kg）剂量组，各组分别给予生理盐水或药物连续4周。

1.4 24小时UTP 及血清生化指标检测

收集样本后按照试剂盒要求使用全自动生化分析仪检测样本各指标，包括尿蛋白、血肌酐、血尿素氮。

1.5大鼠肾脏组织中ROS、SOD和MDA测定

收集样本后按照试剂盒要求，应用DirectDetect™ Spectrometer-Sample Measuring红外微定量分析仪直接检测蛋白浓度，按照试剂盒说明书要求对样品进行处理，测定其活性及含量。

1.6 ELISA方法检测大鼠肾脏组织IL-2、IL-6和TNF-a含量

收集样本后按照试剂盒要求操作，3500r/min，离心15min，收集上清液，按照ELISA试剂盒说明书要求测定IL-2、IL-6和TNF-a含量

1.7统计分析

 采用SPSS19.0 进行统计学分析，所有数据用表示，P＜0.05表示具有显著性差异。

2结果

2.1尿蛋白、血肌酐、血尿素氮结果

与空白组相比，模型组24h尿蛋白、血肌酐、血尿素氮升高（P＜0.05），差异具有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，中药高中低治疗组24h尿蛋白、血肌酐、血尿素氮显著降低（P＜0.05），且高剂量效果最好，见表一。

表1参蛭活血汤对膜性肾病大鼠尿蛋白、血肌酐、血尿素氮（，n=6）

与空白组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05

2.2

大鼠肾脏组织中ROS、SOD和MDA含量变化

如表2所示，与空白组比较，模型组中ROS和MDA含量明显增加，参蛭活血汤高、中、低组都能够明显降低ROS和MDA含量，且参蛭活血汤高、中、低组均可以使SOD含量明显升高，且呈剂量依赖性，表明参蛭活血汤能够抑制氧化应激状反应从而起到降低尿蛋白起到保护肾功能的作用。

表2参蛭活血汤对膜性肾病大鼠氧化应激损伤影响（，n=6）

与空白组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05

2.3大鼠肾脏组织IL-2、IL-6和TNF-a含量测定

如表3所示，与对照组比较，模型组大鼠肾组织中炎性因子TNF-α，IL-1和IL-8含量明显增加（P<0.05）；与模型组比较，参蛭活血汤各组大鼠肾组织中炎性因子TNF-α，IL-1和IL-8含量明显降低（P<0.05），且高剂量参蛭活血汤抑制炎性因子效果最佳。

表3 参蛭活血汤对膜性肾病大鼠肾脏组织IL-2、IL-6和TNF-a含量（，n=6）

与空白组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05

3讨论

膜性肾病是一种常见的肾小球疾病并且是肾病综合征最常见的原因之一。膜性肾病的发病率约占全世的原发肾病的10%，在西方国家甚至达到30%[9–11]。然而，在过去的十年里，膜性肾病在我国发生频率呈上升趋势，年平均增长率为13% [12，13]。从这个趋势预测，膜性肾病可能很快成为我国肾病的主导类型。

参蛭活血汤君药黄芪补气升阳，气能行血，兼有化瘀。水蛭破血逐瘀，力峻效宏。黄芪与水蛭合用，益气行血，标本兼顾。臣药桃仁、红花助水蛭活血，党参甘平，补脾肺气，三药合用祛瘀活血，而不伤正气。当归补血活血，补益气阴的同时疏通气血，畅达经脉。佐药赤芍凉血散瘀，麦冬、生地养阴生津，清热凉血，莲子补脾止泻，益肾固精。瘀血久郁易化热。在膜性肾病临床研究发现参蛭活血汤可以显著减低蛋白尿，蛋白尿也是评价肾病发展的重要因素[14]。但是，参蛭活血汤如何调控尿蛋白从而改善肾病的病理过程作用机制并不明确。所以本项目从治疗膜性肾病多从改善症状和控制蛋白尿入手，通过C-BSA与弗氏不完全佐剂制成膜性肾病大鼠的模型入手，应用参蛭活血汤灌胃模型大鼠，检测发现参蛭活血汤可以降低模型大鼠蛋白尿，肌酐，尿素氮。。

氧化应激是指机体内的氧化及抗氧化功能失调，机体内以氧化反应为主，ROS 生成量大于清理量，体内过量的 ROS 引发的一系列生物反应。研究发现，氧化应激在膜性肾病进展中发挥至关重要的作用［15-16］。本研究结果显示，膜性肾病组大鼠体内存在氧化应激反应，膜性肾病模型组对比空白组中ROS和MDA含量显著增加，SOD含量显著降低；参蛭活血汤高、中、低组都能够显著降低ROS和MDA含量，并且提高SOD含量； 结果表明参蛭活血汤具有抗氧化作用，当机体受到有害性外源刺激或内源性 ROS 大量产生超过机体的清除能力时提高机体清除能力，抑制ROS产生降低细胞和机体的损伤。并且参蛭活血汤可以通过调节MDA抑制ROS攻击不饱和脂肪酸抑制肾小球细胞死亡。

氧化应激和慢性炎症是膜性肾病的两个主要表现，由于炎性介质的参与，膜性肾病被认为是一种免疫介导的炎性疾病。研究结果表明可以通过抑制Il-1和IL-6的表达，减缓膜性肾病的进程。本研究结果显示究参蛭活血汤可以降低由C-BSA注射造成的膜性肾病所引起的IL-2、IL-6和TNF-a蛋白含量增加及氧化损伤，最终降低肾脏炎症从而达到延缓膜性肾病的发生发展。

【参考文献】

[1]刘冬梅,袁华.参蛭活血汤联合氯沙坦钾片治疗过敏性紫癜性肾炎对患者炎症因子、肾功能的影响分析[J].四川中医,2021,39(04):122-125.

[2]Ponticelli, C., Glassock, R.J., 2014. Glomerular diseases: membranous nephropathy–a modern view. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. 9, 609–616.

[3]Zhang, X.D., Cui, Z., Zhang, M.F., Wang, J., Zhang, Y.M., Qu, Z., Wang, X., Huang, J., Wang, F., Meng, L.Q., Cheng, X.Y., Wang, S.X., Liu, G., Zhao, M.H., 2018e. Clinical implications of pathological features of primary membranous nephropathy. BMC Nephrol. 19, 215.

[4]Feng, Y.L., Lei, P., Tian, T., Yin, L., Chen, D.Q., Chen, H., Mei, Q., Zhao, Y.Y., Lin, R.C., 2013. Diuretic activity of some fractions of the epidermis of Poria cocos. J. Ethnopharmacol. 150, 1114–1118.

[5]周俊,徐世茹,王骏等.青年与老年特发性膜性肾病临床病理特点和预后分析[J].兵团医学,2021,19(01):31-33.

[6]赵美眯.肾功能障碍的药物治疗[J].日本医学介绍,2005(09):412-413.

[7]李鑫,雷根平,冯喆等.基于足细胞损伤探讨中医药干预膜性肾病研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2023,29(12):257-264.DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.20221905.

[8]李绍慧,高飞,郝文霞等.加味升降散调控HIF-1α/NOX4信号通路对膜性肾病大鼠氧化应激和凋亡的影响[J].中国实验方剂学杂志,2021,27(19):66-72.DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.20211937.

[9] A. McGrogan, C.F. Franssen, C.S. de Vries, The incidence of primary glomerulonephritis worldwide: a systematic review of the literature, Nephrol. Dial. Transplant. 26 (2011) 414–430. [10] D.C. Cattran, P.E. Brenchley, Membranous nephropathy: integrating basic science into improved clinical management, Kidney Int. 91 (2017) 566–574.

[11] X. Pan, J. Xu, H. Ren, W. Zhang, Y. Xu, P. Shen, X. Li, W. Wang, X. Chen, P. Wu, X. Feng, C. Hao, N. Chen, Changing spectrum of biopsy-proven primary glomerular diseases over the past 15 years: a single-center study in China, Contrib. Nephrol. 181 (2013) 22–30.

[12] X. Xu, G. Wang, N. Chen, T. Lu, S. Nie, G. Xu, P. Zhang, Y. Luo, Y. Wang, X. Wang, J. Schwartz, J. Geng, F.F. Hou, Long-term exposure to air pollution and increased risk of membranous nephropathy in China, J. Am. Soc. Nephrol. 27 (2016) 3739–3746.

[13] E.P. McQuarrie, C.M. Stirling, C.C. Geddes, Idiopathic membranous nephropathy and nephrotic syndrome: outcome in the era of evidence-based therapy, Nephrol. Dial. Transplant. 27 (2012) 235–242

[14] Borch-Johnsen K . Incidence of Nephropathy in IDDM as Related to Mortality. Costs and Benefits of Early Intervention[J]. Springer US, 1998.

[15]牛衍龙,曹建民,周绮云等.虾青素复合有氧运动对D-半乳糖诱导大鼠肾脏衰老的干预作用及其机制[J].中国应用生理学杂志,2021,37(04):433-438.

[16]袁清,洪善娟,韩澍等.生理剂量乙醇预处理调控氧化应激以减轻小鼠肾缺血再灌注损伤[J].中华移植杂志(电子版),2011,5(03):193.（课题来源：黑龙江省中医药学会肾病分会青年中医药科研项目；课题编号：ZHY19-065）

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