简介:摘要目的构建细胞凋亡受体通路相关蛋白FasL表达的RNA干扰(RNAi)质粒,为研究FasL参与的细胞信号通路提供稳定转染细胞的RNA干扰质粒。方法选取FasL基因的19nt特异性序列,设计针对FasL的shRNA序列,应用基因重组技术克隆到pSilencer1.0-U6表达载体中,EcoRI和ApaI进行双酶切和DNA测序鉴定重组克隆,在脂质体的介导下包含FasL基因RNAi的重组载体转染脐静脉血管内皮细胞,转染48h后,收集细胞裂解液,Westernblotting分析对照组与转染组FasL蛋白的表达水平。结果双酶切证实shRNA正确插入pSilencer1.0-U6质粒,DNA测序证实插入的序列正确;FasL基因RNAi的载体转染血管内皮细胞成功;Westernblotting结果显示与空质粒对照组比转染组细胞FasL表达下调。结论成功构建人FasL基因RNA质粒,为研究FasL参与的细胞信号通路提供了稳定的转染细胞载体。
简介:客观干扰素(IFN)和ribavirin(RBV)的联合是为丙肝的标准治疗病毒(HCV)感染。HCV遗传型2a对治疗证明了更顺从,但是它的功效是还有限的。这研究试图在HCV遗传型2a感染的一种情况中调查差的反应的机制。方法:我们从一个病人分析了HCVRNA的动态变化,与HCV遗传型2a感染了,显示出差的virological回答到是的IFN/RBV判定了12在由HCV的治疗的开始以后的星期克隆定序。然后,我们构造了subgenomic日语有人性化的Gaussia的暴发性的hepatitis-1(JFH1)replicon和不同妄想的replicons酶基因。妄想的replicons从subgenomicJFH1replicon,NS5A区域被病人顺序从pre/posttreatment在代替被导出,并且到IFN的妄想的replicons危险性被相对Gausia酶活动评估。预告的处理HCV定序的结果显得几乎一致,并且quasispecies变化是进一步的在12星期治疗以后简化的更多。而且,quasispecies变化似乎相对,在NS5A更多样化为IFN反应关键的一个区域,和每妄想的replicons展出了不同反应到IFN。结论在长期的感染的功课期间,HCV人口似乎被使适应病人免疫学的系统,并且推进被IFN/RBV治疗的联合选择,显示quasispecies可以完全与IFN的与那些不同的目标由另外的药的增加消除了。另外,到IFN的妄想的replicon的各不同的反应与氨基酸变化在或在在长期的感染和IFN/RBV治疗期间决定NS5A的区域(ISDR)的IFN敏感附近有关是最可能的。
简介:RNA干扰(RNAi)是生物体内源基因发生转录后特异性降解的一种生理现象,作为抵抗病毒的免疫机制,广泛存在于生物体内。RNAi在秀丽隐杆线虫中的发生机制已明确,但昆虫的系统性RNAi不同于线虫,在昆虫中尚未发现线虫跨膜蛋白SID.2的同源蛋白,且果蝇中不存在依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRP),但存在具有相似活性的物质。昆虫发生RNAi的效率不仅与靶标基因自身及双链RNA的选择有关,而且与虫体的发育状态及摄入双链RNA的剂量相关。随着RNAi在昆虫中作用特点的阐明,RNAi的应用价值也逐渐体现。近年来,通过RNAi沉默靶标基因,不但促进了昆虫基因功能研究的发展,而且被广泛用于重要农业害虫抗药性基因的研究。最新研究表明,RNAi结合第2代测序技术,针对非模式昆虫,能迅速找到具有致死效应的靶标序列,加快了利用RNAi技术生产生物农药的步伐。
简介:摘要RNA干扰技术已经迅速的被发展成为一种治疗手段,用于特异的下调基因从而减轻病痛。这一技术特别适用于由于病毒感染的疾病。现在大量的研究已经表明无论在体内还是在体外,RNA干扰都可以抑制病毒。这里有一个基本原则每一个的病原物RNA干扰治疗都必须量身定做,其中包括1.发挥干扰的RNA的导入方法途径,2.给药途径,3.目的基因,4.RNA干扰作用的持续时间。尽管对于每种病毒都可以制定有效的策略但是他们都面临着同样的挑战。重要的是,治疗策略必须考虑到在病毒基因组可能出现的极快速进行,以及利用计算和生物信息学方法来辅助治疗策略以防止病毒逃逸。此外,所有的RNA干扰治疗策略都需将发挥干扰作用的核酸序列导入到靶细胞中,这将受益于基因设计和导入方法的发展。这里我们总结了在抗病毒RNA干扰方面取得的重要进展,讨论如何将这些发现有效的应用到诊断治疗中。
简介:摘要目的探讨肾综合征出血热患者血清中HV-RNA的RT-PCR检测的可行性,以及扩增的部分HV靶基因的测序分析。方法设计并合成了两套分别互补于HVM基因片段和S基因片段的引物,建立检测肾综合征出血热患者临床血清标本中HV基因的RT-PCR方法,并对扩增的部分HV靶基因进行测序分析和比较。结果206份HFRS患者血清经RT-PCR扩增后,得到特异性的M和S靶基因片段,对急性期HFRS患者血清经RT-PCR检测,结果显示,S基因片段引物对HV靶基因检出率为60.93%,M基因片段引物检出率为40.63%,S基因片段引物的扩增效果显著优于M基因片段,两者相比具有统计学意义(x2=3.67,P<0.05)。结论S基因片段引物的扩增效果优于M基因片段引物。
简介:目的了解循环微RNA(miR)-92a在老年稳定性心绞痛(SAP)患者中的表达。方法选择sAP患者116例,分为老年组(年龄≥60岁)66例,非老年组(年龄〈60岁)50例。比较老年SAP患者循环miR-92a表达,方差成分分析2组患者一般临床资料及其交互效应项对SAP患者循环miR-92a表达的贡献。比较2组合并及禾合并糖尿病患者循环miR-92a表达。结果sAP患者年龄与循环miR-92a表达呈正相关(相关系数0.217,P〈0.05)。老年组循环miR-92a表达明显高于非老年组(P=0.056)。方差成分分析显示,年龄、糖尿病影响sAP循环miR92a表达。老年组合并糖尿患者循环miR-92a表达明显高于未合并糖尿病患者(P〈0.01),非老年组合并糖尿病患者循环miR-92a表达明显高于表合并糖尿病患者(P〈O.05)。老年组合并糖尿病发生率33.3%明显高于非老年组16.0%(P〈0.05)。结论老年患者循环miR-92a表达升高不是年龄升高所致。提示老年SAP患者循环miR-92a表达升高要特别注意引发血管内皮损伤的糖尿病。
简介:目的构建以大鼠CTGF和TIMP-1基因为靶点的双重RNA干扰表达载体质粒,以检测其转染肝星状细胞的效率.方法筛选出对CTGF和TIMP-1基因最有效的RNA干扰靶位,各设计1对含有短发夹结构的RNA干扰靶点序列,分别克隆到质粒载体psiRNA-DUO-GFPzeo,构建含目的靶基因片段的重组质粒载体psiRNA-GFP-CT-GF、psiRNA-GFP-TIMP-1和psiRNA-GFP-Com(含有CTGF和TIMP-1),进行酶切和测序鉴定.将构建成功的重组质粒psiRNA-GFP-CTGF、psiRNA-GFP-TIMP-1和psiRNA-GFP-Com转染大鼠肝星状细胞,在荧光显微镜下观察质粒转染情况,用流式细胞仪检测转染效率.结果酶切与测序结果提示重组质粒psiRNA-GFP-CTGF、psiR-NA-GFP-TIMP-1和psiRNA-GFP-Com成功构建;成功将重组质粒psiRNA-GFP-CTGF、psiRNA-GFP-TIMP-1和psiRNA-GFP-Com转染肝星状细胞,在24小时,空质粒组、CTGF组、TIMP-1组和CTGF+TIMP-1组转染效率分别为15±2%、13±1%、15±1%和14±2%,均低于质粒psiRNA-GFP-Com转染组(Com组,20±2%,P〈0.05);在48小时,空质粒组、CTGF组、TIMP-1组和CTGF+TIMP-1组转染效率分别为10±2%、9±1%、8±2%和10±1%,均低于Com组的15±2%(P〈0.05).结论成功构建靶向大鼠CTGF和TIMP-1最有效的RNA干扰靶位的双重RNA干扰表达质粒,能转染至肝星状细胞,并且psiRNA-GFP-Com转染效率最高.
简介:目的探讨MTA1对食管癌转移相关基因的影响。方法用RNA干扰的方法在食管癌细胞系KYSE150中沉默MTA1基因的表达,随后进行转移相关基因芯片分析。以两次芯片分析中均上调2倍以上(或下调1/2)为差异显著基因。通过DIVID生物信息学数据库进行geneontology的通路分析。结果在两次基因芯片分析中均有意义上调的基因共有7个,分别是LAMC1、MMP14、MMP15、MDM2、AP15、ODC1、PTGS2;而两次均显著下调的基因共有14个,它们是CSF1R、HGF、IGF2、ITGA6、MMP9、MMP11、MMP13、CASP8、CTSD、TMPRSS4、THBS2、TIMP1、ENPP2、SNCG。通过在DAVID生物信息学数据库中对上述表达差异显著的基因进行通路分析,结果提示差异基因主要富集在5条信号通路上,分别是肿瘤信号通路(MDM2、CASP8、CSF1R、HGF、ITGA6、LAMC1、MMP9、PTGS2)、ECM受体整合信号通路(LAMC1、THBS、ITGA6)、基质金属蛋白酶信号通路(TIMP1、MMP9)、小细胞肺癌信号通路(ITGA6、Cox2)和黏着斑信号通路(ITGA6、HGF、IGF2)。结论MTA1参与了转移相关的一系列分子改变事件,尚需进一步的分子生物学方法验证这些基因调控的信号途径。
简介:目的T7RNA聚合酶催化的荧光扩增技术(CellularFACTT)检测人循环肿瘤细胞中hTERT表达。方法以亲和素作为连接分子,连接生物素化的检测抗体和生物素化的DNA,加入r17RNA聚合酶进行转录扩增反应,对生成的RNA产物进行荧光检测,并同时用酶联免疫方法检测hTERT及CEA作为比对。结果64例结直肠癌患者血清hTERT阳性率是45.3%(29/64),血清CEA阳性率是57.8%(37/64);CellularFACTT方法检测循环肿瘤细胞的hTERT检出率为81.3%(52/64)。其检测的灵敏度与酶联免疫检测方法有显著差异P〈0.01。结论T7RNA聚合酶催化的荧光扩增技术较酶联免疫检测方法具有更高的敏感性,有可能作为一种新的检测方法用于临床的诊断。
简介:目的:观察DcR3基因小干扰RNA(siRNA)对人结肠癌SW480细胞裸鼠皮下移植瘤DcR3基因表达的影响。方法:建立结肠癌SW480细胞裸鼠皮下移植瘤模型,瘤体注射脂质体与DcR3siRNA混合物,转染DcR3siRNA,免疫组织化学及RT-PCR检测观察DcR3基因的表达。结果:建立了结肠癌SW480细胞裸鼠皮下移植瘤模型;治疗后,治疗组移植瘤明显减小,空白对照组、阴性对照组肿瘤体积显著大于治疗组(P〈0.01);各组肿瘤组织中DcR3基因均有不同程度的表达,治疗组表达程度明显低于阴性对照组及空白对照组(RT-PCRP〈0.05,免疫组化P〈0.01)。结论:人结肠癌SW480细胞在裸鼠皮下有良好的成瘤性;脂质体与DcR3siRNA混合物可特异性抑制结肠癌裸鼠皮下移植瘤内DcR3基因的表达。