简介:背景:具核梭杆菌(Fn)是口腔常见的致病菌,研究发现Fn与结直肠癌的发生、发展密切相关,尤其是炎症相关性结直肠癌。目的:探讨Fn感染在结肠癌细胞中形成炎性微环境的机制。方法:构建Fn感染Caco-2细胞的炎症模型,行miRNA测序。将miR-181bmimics或inhibitor转染Fn感染的Caco-2细胞。以qRT-PCR和蛋白质印迹法分别检测TNF-αmRNA和蛋白表达,ELISA法检测上清液中TNF-α含量,Transwell小室法检测穿膜淋巴细胞数。结果:Fn组TNF-αmRNA和蛋白表达均显著高于对照组(P〈0.05),上清液中TNF-α含量显著升高(P〈0.05),穿膜淋巴细胞数量明显增多(P〈0.05)。miRNA测序和qRT-PCR结果均显示,Fn组miR-181b表达较对照组显著降低(P〈0.05)。与对照组相比,miR-181bmimics+Fn组TNF-αmRNA和蛋白表达显著降低(P〈0.05);而miR-181binhibitor组TNF-αmRNA和蛋白表达均显著升高(P〈0.05)。生物信息学工具和双荧光素酶检测证实TNF-α可能为Caco-2细胞中miR-181b的靶基因。结论:Fn通过抑制Caco-2细胞中miR-181b表达而上调TNF-α表达,募集淋巴细胞形成炎性微环境。
简介:摘要目的探究肝细胞核因子1α(HNF1α)通过葡萄糖转运蛋白(GLUT)调控肾脏葡萄糖重吸收的机制。方法构建小鼠HNF1α表达载体,将重组质粒转染人胚肾HEK293T细胞和人肾小管上皮细胞HK2中过表达HNF1α,将HNF1α siRNA和GLUT2 siRNA转染入HEK293T细胞,采用流式细胞仪检测荧光葡萄糖类似物2-NBDG被细胞吸收的情况。采用Western印迹法检测HNF1α基因沉默后对GLUT2表达的影响。通过实时定量PCR检测HNF1α下游靶基因如GLUT2、钠-葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT2)、胰岛素诱导基因1(INSIG1)等的mRNA水平,通过共聚焦免疫荧光检测GLUT2在肾上皮细胞的定位情况,使用荧光素酶报告基因和Western印迹法检测HNF1α对GLUT2的转录激活能力。通过凝胶迁移实验(EMSA)和染色质免疫共沉淀(ChIP)实验检测HNF1α与GLUT2的结合作用。结果过表达HNF1α摄取2-NBDG的细胞比例明显高于对照组(P<0.01),HNF1α和GLUT2基因沉默后细胞对2-NBDG吸收作用减弱,HNF1α基因沉默后GLUT2表达减少。与对照组相比,过表达HNF1α使得肾脏包括GLUT2在内的有关糖转运基因表达水平上升(P<0.01)。过表达HNF1α显著增加GLUT2转录活性,干涉HNF1α可下调GLUT2转录活性。此外,HNF1α可与GLUT2的启动子直接结合。结论HNF1α通过直接结合GLUT2促进其表达,进而调节肾源细胞对葡萄糖重吸收作用。
简介:摘要本研究从1例儿童糖尿病患者入手,详细收集临床资料和追溯糖尿病家族史,临床诊断为青少年的成人起病型糖尿病。提取患者及其一级家属外周血白细胞基因组DNA,扩增目标基因并测序,发现先证者和其父的肝细胞核因子1α基因第4外显子发生核苷酸错义突变(c.779C>T),明确其青少年的成人起病型糖尿病3型的诊断。在1年的随访过程中,先证者应用格列奈类药物治疗后血糖达标,其父调整方案为长效磺脲类促泌剂后血糖明显改善。
简介:摘要目的探讨在肺泡上皮细胞模型中甲型H1N1流感病毒(H1N1病毒)诱导低氧诱导因子-1α(HIF-1α)核转位的分子机制。方法体外培养人肺腺癌上皮细胞(A549细胞),选取对数生长期细胞用于实验。①实验1:采用感染复数(MOI)1.0的H1N1病毒感染细胞24 h,建立H1N1病毒感染的A549细胞模型(H1N1病毒感染组);并设立空白对照组。采用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测细胞中核转运受体蛋白(Importin 4、Importin 7)表达,探讨HIF-1α核转位是否依赖Importin 4、Importin 7。②实验2:采用不同MOI(0、0.1、0.5、1.0、2.0、4.0)的H1N1病毒感染细胞24 h;采用MOI 1.0的H1N1病毒感染细胞0、3、6、12、18、24、36 h。采用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞中胞裂蛋白9基因变异剪接体1(SEPT9_i1)mRNA表达,探讨不同MOI和感染时间对SEPT9_i1表达的影响。③实验3:采用小干扰RNA(siRNA)转染细胞24 h抑制SEPT9_i1,建立沉默SEPT9_i1的A549细胞模型(siRNA-SEPT9_i1组);并设立空白对照组和空白载体对照组(siControl组)。3组细胞转染24 h后均给予MOI 1.0的H1N1病毒感染24 h,采用实时荧光定量RT-PCR检测细胞中SEPT9_i1 mRNA表达,以探讨siRNA对SEPT9_i1的干扰效率。④实验4:将细胞分为siControl组和siRNA-SEPT9_i1组,两组细胞转染方法同实验3。转染24 h后,两组均以MOI 1.0的H1N1病毒感染细胞,于24 h采用免疫荧光法观察细胞中HIF-1α核内外分布情况;于6、12、24、36、48 h采用实时荧光定量RT-PCR检测病毒M基因表达,以明确SEPT9_i1对HIF-1α核转位和病毒复制的影响。⑤实验5:将细胞分为空白对照组(完全培养基)、SP600125组〔100 μmol/L的c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路抑制剂SP600125处理细胞2 h〕、H1N1病毒感染组(MOI 1.0的H1N1病毒感染细胞24 h)和H1N1病毒+ SP600125组(100 μmol/L的SP600125预处理2 h后,再加入MOI 1.0的H1N1病毒感染细胞24 h)。采用实时荧光定量RT-PCR检测细胞中SEPT9_i1 mRNA和病毒M基因表达,探讨JNK信号通路对SEPT9_i1表达及病毒复制的影响。结果①实验1:与空白对照组相比,H1N1病毒感染组A549细胞中Importin 4和Importin 7蛋白表达差异均无统计学意义〔Importin 4蛋白(Importin 4/GAPDH):1.08±0.03比1.05±0.03,Importin 7蛋白(Importin 7/GAPDH):0.87±0.11比0.78±0.03,均P>0.05〕。说明H1N1病毒感染A549细胞中HIF-1α核转位可能不依赖Importin 4和Importin 7。②实验2:A549细胞中SEPT9_i1 mRNA表达随H1N1病毒MOI增加及感染时间延长呈升高趋势,分别于MOI 2.0和感染18 h达峰值,与MOI为0或感染0 h比较差异均有统计学意义(2-ΔΔCT:MOI 2.0为1.39±0.05比1.00±0.00,18 h为1.47±0.04比1.00±0.00,均P<0.01)。说明H1N1病毒感染A549细胞中SEPT9_i1表达与病毒MOI及感染时间相关。③实验3:与空白对照组比较,siRNA-SEPT9_i1组A549细胞中SEPT9_i1 mRNA表达明显下调(2-ΔΔCT:0.38±0.11比1.00±0.00,P<0.01),而siControl组与空白对照组比较差异无统计学意义(2-ΔΔCT:1.03±0.16比1.00±0.00,P>0.05)。说明沉默SEPT9_i1可抑制H1N1病毒感染A549细胞中SEPT9_i1表达。④实验4:siRNA-SEPT9_i1组H1N1病毒感染A549细胞中HIF-1α核转位较siControl组明显减少。siControl组感染H1N1病毒后细胞中病毒M基因表达逐渐升高,48 h达峰值;siRNA-SEPT9_i1组A549细胞中病毒M基因表达明显下调,48 h与siControl组比较差异有统计学意义(2-ΔΔCT:3.47±0.66比8.17±0.38,P<0.05)。说明沉默SEPT9_i1后可以抑制H1N1病毒感染A549细胞中HIF-1α核转位和病毒复制。⑤实验5:H1N1病毒感染组A549细胞中SEPT9_i1 mRNA和病毒M基因表达较空白对照组明显升高;而H1N1病毒+ SP600125组A549细胞中SEPT9_i1 mRNA和病毒M基因表达均明显低于H1N1病毒感染组(2-ΔΔCT:SEPT9_i1 mRNA为0.12±0.10比1.53±0.14,病毒M基因为2.13±0.10比4.66±0.14,均P<0.05);SP600125组上述指标与空白对照组比较差异均无统计学意义。说明H1N1病毒感染A549细胞中JNK信号通路可以调控SEPT9_i1的表达,而抑制JNK信号通路可以下调SEPT9_i1的表达及抑制病毒复制。结论H1N1病毒通过激活JNK信号通路调控SEPT9_i1的表达,从而提高HIF-1α转运效率以及促进病毒复制。
简介:摘要目的观察长链非编码RNA肝细胞核因子1α反义链1(lnc HNF1A-AS1)对食管癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响并探讨其作用机制。方法选取2017年8月至2019年11月于河南省人民医院行根治性切除术的食管鳞癌患者85例作为研究对象,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测食管癌和癌旁组织lnc HNF1A-AS1的mRNA表达水平;构建短发卡RNA(shRNA)-Control和shRNA-HNF1A-AS1慢病毒稳定细胞系;采用生物信息学和双荧光素酶报告基因实验分析lnc HNF1A-AS1和miR-1-3p的靶向关系;采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测shRNA-Control和shRNA-HNF1A-AS1细胞的增殖水平;采用Transwell检测shRNA-Control和shRNA-HNF1A-AS1细胞的迁移能力;采用原位缺口末端标记法(TUNEL)染色检测shRNA-Control和shRNA-HNF1A-AS1细胞的凋亡水平;采用蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、程序性死亡因子10(PDCD10)的表达;组间比较采用t检验及χ2检验。结果食管癌组织(1.77±0.10)lnc HNF1A-AS1相对表达水平高于癌旁组织(0.39±0.02)(t=7.294,P<0.05),差异有统计学意义。生物信息学分析显示lnc HNF1A-AS1是miR-1的潜在作用靶点。shRNA-HNF1A-AS1细胞吸光度(A)值(0.51±0.03)低于shRNA-Control细胞A值(1.65±0.11),差异有统计学意义(t=4.904,P<0.05)。shRNA-HNF1A-AS1细胞[(62.08±5.96)个]的迁移数目低于shRNA-Control细胞[(150.44±10.21)个],差异有统计学意义(t=3.846,P<0.05)。shRNA-HNF1A-AS1细胞[(83.85±6.69)个]的凋亡数量高于shRNA-Control细胞[(25.92±4.08)个],差异有统计学意义(t=4.759,P<0.05)。shRNA-HNF1A-AS1细胞中Cyclin D1和PDCD10的蛋白相对表达水平(0.55±0.05、0.59±0.04)低于shRNA-Control细胞(1.68±0.09、1.80±0.11),差异有统计学意义(t=4.363、5.063,P<0.05)。miR-1-3p组细胞Cyclin D1和PDCD10的蛋白相对表达水平(0.38±0.04、0.44±0.05)低于shRNA-Control细胞(1.76±0.10、1.72±0.12),差异有统计学意义(t=5.176、4.729,P<0.05)。结论lnc HNF1A-AS1可能通过靶向下调miR-1-3p的表达,促进食管癌细胞的增殖和迁移,抑制食管癌细胞的凋亡。