简介:目的:构建带Myc标签的LC3B—PLA2基因的真核表达质粒,获得LC3B—PLA2融合蛋白,并应用LC3B—PLA2研究Atg4B对LC3B的切割作用。方法:以本实验室保存的乳腺文库为模板,PCR扩增获得LCgB序列,与PLA2G]O拼接后插入pCMV—Myc载体,用构建的重组质粒转染HEK293T细胞,Western印迹检测融合蛋白的表达,用LC3B—PLA2与Atg4B共转染的方法检测Atg4B对LC3B的切割作用。结果:菌液PCR、重组质粒双酶切及测序均表明重组质粒构建成功,Western印迹结果表明融合蛋白在HEK293T细胞中获得表达,LC3B—PLA2真核表达蛋白能够应用于Atg4B对LC3B切割作用的研究。结论:构建了pCMV—Myc—LC3B—PLA2真核表达质粒,LC3B—PLA2融合蛋白在Atg4B对LC3B切割作用的研究中至关重要,为进一步研究Atg4B在自噬过程中的作用奠定了基础。
简介:用原子力显微镜(AFM)观察线性DNA并探讨其成像条件。用RT-PCR技术扩增柯萨奇B1病毒VP1基因DNA片段,纯化回收后配制成含和不含1mmol/LMgCl2的水溶液,DNA终浓度为100μg/ml。分别取20μl滴加在新鲜解理的云母片上,吸收1min,用滤纸吸去残液,氮气吹干,在室温下采用MultiModeAFMNanoscopeⅢa的敲击模式成像。同时比较新制备和多次使用过的探析所获得图像的质量,对两种探针进行扫描电镜观察。电泳证明获得了0.83kb的VP1基因DNA线性片段,Mg^2+存在时,DNA在云母片上吸附延展较好,所获图像质量优于无Mg^2+时。新制备的探针较多次使用过的探针所获图像分辨率更高。DNA分子的表现宽度为18±2.9nm,高度为0.8±0.2nm。说明AFM能以高分辨率直接观察DNA分子,Mg^2+的存在和高质量的探针有助于获得理想的图象。
简介:克隆河南人免疫缺陷病毒(HIV)感染者HIV-1B型株tat基因完整编码框序列,并分析比较其编码产物的序列结构特点.使用重叠PCR技术,从河南省1名HIV-1感染者外周血标本中扩增出tat基因第一和第二外显子并重组为完整的tat基因序列.获得的HIV-1B病毒株tat基因,第一外显子为263bp,第二外显子为214bp.将该基因编码产物与其他HIV-1株Tat蛋白经DNA软件编辑并翻译成蛋白质,使用ClustalX1.81进行多序列对比分析发现,第一外显子编码产物的3个保守区域的氨基酸组成大致相同,只有少数氨基酸存在差异.由于Tat蛋白不同病毒株间有高度保守的Cys富集区、核心区和碱性氨基酸富集区,tat基因的克隆为研究其功能并以其为靶点设计和筛选抗艾滋病的药物奠定了基础.
简介:目的:分离羽衣甘蓝S13-b位点受体激酶(SRK13-b)基因并进行序列及结构域分析,构建SRK13-b结构域的原核表达载体并进行重组蛋白质的原核表达和纯化。方法:提取羽衣甘蓝S13-bS13-b自交不亲和系花期柱头的RNA,用RT-PCR法分离SRK13-b基因;将编码SRK13-b激酶结构域的序列插入大肠杆菌表达载体pET-14b中,构建原核表达质粒pET-SRK13-bCT,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS菌株,经0.1mmol/LIPTG诱导,用Ni—NTA亲和层析柱对SRK13-b激酶结构域蛋白进行纯化。结果:分离获得羽衣甘蓝SRK13-b基因的长度为2571bp,编码856个氨基酸,GenBank收录号为EU180597;对SRK13-b激酶结构域蛋白进行诱导表达及纯化,SDS—PAGE显示相对分子质量约43×10^3的蛋白质特异表达,对表达产物进行分离纯化,获得了SRK13-b激酶结构域的融合蛋白。结论:羽衣甘蓝SRK13-b基因的克隆及激酶结构域的原核表达,为研究SRK的功能及自交不亲和性奠定了基础。
简介:HISCL-5000高敏发光全自动免疫分析仪以化学发光酶免疫测定法为工作原理,用碱性磷酸酶标记检测化学发光,采用目前最快速、最灵敏的化学发光底物CDP-Star,曝光时间只需15~60s。反应在液体中进行,实现了短时间内的高效率反应,反应时间可短至17min。我们根据美国临床和实验室标准化协会颁布的EP系列文件,对HISCL-5000分析仪的分析性能进行评价,对相关研究进展做一综述。
简介:大环内酯类抗生素基因工程是近年来生物工程领域研究的一个热点,利用基因工程改造大环内酯类抗生素合成基因,已经合成了100多种"非天然”的天然化合物,为筛选新抗生素开辟了新的途径.本研究以糖多孢红霉菌A226基因组DNA为模板,先用PCR扩增出红霉素合成基因eryKR6两侧片段,再用重叠PCR将其拼接成去除KR6的约3.2kbDNA片段,并克隆于pWHM3载体,构建了同源重组质粒pWHM2201.用PEG介导将pWHM2201转入糖多孢红霉菌A226原生质体.PCR鉴定和生物活性检测均显示pWHM2201已重组到红霉素合成基因位点.在无抗性R3M斜面上生长两代后,制备重组体原生质体,并涂R3M平皿.利用PCR筛选出KR6敲除的突变体糖多孢红霉菌M.