简介:摘要目的探讨脂多糖(LPS)刺激下NUFIP-1介导核糖体自噬在树突细胞(DCs)凋亡中的作用及意义。方法将培养的树突细胞系DC2.4分为空白对照组及LPS刺激6、12、24、48、72 h组(n=5),LPS各亚组加入1 μg/mL LPS培养相应时间。采用Western blot检测各组细胞NUFIP-1及自噬相关蛋白p62和LC3B表达水平,激光共聚焦显微镜检测NUFIP-1在细胞中的表达与定位及其分别与Lyso-tracker、LC3B共定位情况。将载有沉默空载体NS及沉默慢病毒载体NUFIP-1 siRNA感染DC2.4 (n=3),以1 μg/mL LPS刺激24 h,应用流式细胞分析术检测细胞凋亡情况,并采用Western blot检测凋亡相关蛋白包括胱天蛋白酶(cleaved-caspase-3)和Bcl-2表达水平。多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),采用LSD-t法进一步进行组间两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。结果Western blot结果提示,LPS刺激不同时间(6、12、24、48、72 h)后DC2.4中NUFIP-1蛋白表达水平呈现先升高后下降趋势,其中LPS 24 h组NUFIP-1表达水平显著高于空白对照组[空白对照组:(0.6786 ± 0.0820);LPS 24 h组:(1.4830 ± 0.1170),P<0.01]。同时,LPS 24 h组p62表达水平显著低于空白对照组[空白对照组:(0.9087 ± 0.1235);LPS 24 h组:(0.3113 ± 0.5571),P<0.01]。LPS 24 h组LC3B-I向LC3B-Ⅱ的转化显著高于空白对照组[空白对照组:(0.5542 ± 0.1248);LPS 24 h组:(2.5310 ± 0.3119),P<0.01]。激光共聚焦显微镜观察显示,NUFIP-1主要定位于细胞核及核周,LPS刺激后其荧光强度于6 h至24 h呈时间依赖性增强,而刺激48、72 h明显减弱。同时,NUFIP-1与Lyso-tracker及LC3B的共定位较空白对照组显著增强。采用慢病毒感染技术感染NUFIP-1 siRNA可显著下调DC2.4 NUFIP-1表达水平,与空白对照组及空载体组比较分析,差异有统计学意义[空白对照组:(0.6627 ± 0.1707);空载体组:(0.6966 ± 0.1107);siRNA组:(0.1428 ± 0.0296),P<0.05]。流式细胞分析术显示,NUFIP-1 siRNA感染组在LPS刺激后较空白对照LPS 24 h组及空载体LPS 24 h组DC2.4凋亡率显著升高[空白对照LPS 24 h组:(47.91%±1.006%);空载体LPS 24 h组:(70.26% ± 1.011%);siRNA LPS 24 h组:(80.23% ± 2.094%),P<0.01]。Western blot分析进一步证实,NUFIP-1 siRNA感染组相较空白对照组及空载体组在LPS刺激下DC2.4凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3表达显著增强[空白对照LPS 24 h组:(0.4748 ± 0.0876);空载体LPS 24 h组:(0.2849 ± 0.0418);siRNA LPS 24 h组:(0.9733 ± 0.0525),P<0.01],抗凋亡蛋白Bcl-2表达则明显下调[空白对照LPS 24 h组:(0.7810 ± 0.0490);空载体LPS 24 h组:(0.8292 ± 0.0729);siRNA LPS 24 h组:(0.3957 ± 0.0838),P<0.05]。结论LPS刺激后DC2.4中NUFIP-1介导核糖体自噬明显活化,且对DC2.4凋亡具有显著保护效应。
简介:目的:探讨miR-181在白内障晶状体组织中的表达情况,及其对人晶状体上皮细胞凋亡的调控机制。方法:利用Realtimeq-PCR方法,检测年龄相关性白内障患者晶状体前囊膜和人晶状体上皮细胞凋亡模型中miR-181的表达情况;利用Lipofectamine2000瞬时转染miR-181mimic和inhibitor调节人晶状体上皮细胞中miR-181的表达,利用Realtimeq-PCR方法验证转染效率,利用流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化。结果:与对照组相比,年龄相关性白内障患者晶状体前囊膜组和人晶状体上皮细胞凋亡模型组,miR-181的表达显著升高;miR-181mimic转染组,miR-181的表达显著升高,细胞凋亡率显著升高;miR-181inhibitor转染组,miR-181的表达显著降低,细胞凋亡率显著降低,差异均有统计学意义(P〈0.01)。结论:miR-181在年龄相关性白内障晶状体组织中呈高表达,miR-181能够促进人晶状体上皮细胞凋亡,从而可能在年龄相关性白内障的发病过程中发挥一定作用,miR-181可能成为白内障非手术治疗的一种新途径,但具体机制有待进一步研究。
简介:摘要目的探讨放射诱导多倍体结肠癌细胞的凋亡和自噬。方法采用14 Gy剂量的X射线处理SW1116细胞,分别在放射处理后的第3天、第5天、第7天、第10天及第25天观察细胞的形态变化,分别记为A组、B组、C组、D组和E组;在第5天、第25天用流式细胞术检测细胞倍性、细胞凋亡的变化;采用Western blot检测细胞周期、凋亡和自噬相关蛋白的表达。结果经14 Gy处理后,SW1116细胞出现多倍体化并伴随细胞体积增大,细胞发生凋亡和自噬。B组多倍体细胞亚群(DNA含量>4 N)比例[(57.50±2.33)%]和凋亡细胞亚群比例[(14.63±1.90)% ]均高于未放射组细胞[(1.90±0.17)%、(7.57±1.42)%],差异有统计学意义(P<0.05)。B组细胞周期相关蛋白周期素B1、细胞分裂周期基因2(cdc 2)表达上调,凋亡抵抗相关蛋白存活蛋白表达上调,自噬相关蛋白自噬微管相关蛋白轻链3(LC3)-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高,自噬特异性底物选择性自噬接头蛋白(p62)蛋白表达下调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论结肠癌多倍体细胞可能通过上调细胞周期相关蛋白、抗凋亡相关蛋白和激活自噬,来维持多倍体细胞存活并发生去倍化增殖,参与多倍体细胞的放射抵抗性和治疗后肿瘤的复发。
简介:目的:探讨αB-晶状体蛋白(αB-crystallin)高表达对人皮肤角质形成细胞(HaCaT)存活和凋亡的影响。方法:构建αB-crystallin的真核表达载体,转染至Hacarr细胞中并筛选出稳定高表达αB-crys-tallin的HaCaT细胞株,MTT法和流式细胞术分别检测高表达αB-crystallin对HaCaT细胞的细胞存活率和细胞凋亡率的影响。结果:成功筛选出高表达仅B—crystallin的HaCaT/CRYAB-1、HaCaT/CRYAB-2,该两者的αB-crystallin表达水平均较亲代HaCaT明显升高。αB-crystallin高表达的HaCaT细胞在H2O2处理后细胞存活率明显升高(t=5.23,P〈0.05),细胞凋亡率明显下降(t=15.09,P〈0.05)。结论:αB-crystallin具有促人角质形成细胞存活和抗细胞凋亡的作用。
简介:肿瘤是一种多基因疾病,其发生、发展涉及多条信号通路中多种基因的调控。细胞凋亡异常是肿瘤形成及耐药的重要机制,而诱导凋亡已成为治疗肿瘤的主要方法之一。凋亡抑制蛋白家族(inhibitorofapototicproteins,IAPs)是近年来受到普遍关注的蛋白因子,且都具有高度保守的杆状病毒凋亡抑制因子重复序列的结构域,可作用于凋亡信号通路中重要的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白(Caspases)级联反应的起始或效应阶段,调节Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9功能.从而明显抑制细胞凋亡。