简介:目的:建立无线粒体DNA(mtDNA)的人肺腺癌ρ^0A549细胞系。方法:在含50ng/mL溴化乙锭(EB)、100μg/mL丙酮酸钠和50μg/mL尿嘧啶核苷的RPMI1640细胞培养基中传代培养A549细胞;用低剂量EB连续诱导培养35d后,采用光镜观察、TaqMan探针法实时荧光定量PCR(qPCR)和Western印迹鉴定无mtDNA的ρ^0A549细胞系;采用MTT法测定ρ^0A549细胞增殖曲线。结果:倒置显微镜下野生型ρ^+A549细胞为多角形,ρ^0A549细胞形态呈拉长枝状;qPCR结果显示,低剂量EB诱导35d的ρ^0A549细胞中无mtDNA的存在。Western印迹结果显示,ρ^+A549细胞中能表达核基因编码的线粒体蛋白SDHA和ATP5A,也能表达线粒体基因组编码的蛋白MT-COXI和MT-ATP6;ρ^0A549细胞中无MT-COXI和MT-ATP6蛋白表达,但核基因编码的SDHA和ATP5A蛋白能够正常表达。MTT结果显示,与ρ^+A549细胞相比,ρ^0A549细胞生长速度明显减慢,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:构建和鉴定了无mtDNA的人肺腺癌ρ^0A549细胞系,为后续探讨mtDNA缺失或突变与人肺腺癌发生之间的关系奠定了实验基础。
简介:目的观察微小RNA(microRNA,miR)-142-3p对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导的心肌肥厚中线粒体功能的影响。方法我们使用Sprague-Dawley(SD)大鼠的乳鼠心肌细胞,细胞培养后分成4组:空白组;AngII组;miRnc+AngII组;miR-142-3pmimic+AngII组。分别往细胞中转染相同浓度的miR-142-3p和miRnc质粒6h,实时定量聚合酶链反应(real-timepolymerasechainreaction,rt-PCR)检测实验组miR-142-3pmRNA表达增多,提示细胞质粒转染成功,再用10-6mol/L浓度的AngII诱导细胞48h,使用线粒体Mito-RedTracker处理细胞30min,共聚焦显微镜观察细胞中线粒体密度的变化;使用流式细胞仪检测线粒体膜电位变化。结果与空白组相比,AngII组的线粒体膜电位减低(n=3,P<0.01);与AngⅡ+miRnc组相比,AngⅡ+miR-142-3p组的线粒体膜电位增加(n=3,P<0.01)。与空白组相比,AngⅡ组的线粒体荧光数量减低(n=3,P<0.01);与AngⅡ+miRnc组相比,AngⅡ+miR-142-3p组的线粒体荧光数量增加(n=3,P<0.01)。结论在AngⅡ诱导心肌肥大过程中miR-142-3p对心肌线粒体具有保护作用。
简介:目的:构建表达基因编辑钙探针(GECIs)的细胞系HeLa-GECIs,探究细胞应答外界ATP刺激中钙离子在细胞内的响应和变化。方法:分别用能够直接通过荧光强度反映细胞胞浆内和线粒体内钙离子相对浓度的2种钙探针cyto-GCaMP6和4mt-GCaMP6感染HeLa细胞,获得2种表达钙离子探针的HeLa细胞系;在感染了2种腺病毒探针24h后,用共聚焦荧光显微镜检测荧光探针在HeLa细胞内的表达情况;在表达2种钙探针的细胞的培养基中加入外源ATP,用Time-lapse成像动态观测技术观察HeLa细胞内钙离子对外环境中ATP的响应。结果:共聚焦荧光显微镜观察,确定95%以上的细胞表达了对应的钙离子指示荧光探针;Time-lapse成像动态观测技术观察发现,在细胞培养基中加入ATP后,细胞胞浆钙探针荧光强度瞬时(3~6s)升至10倍,200s后逐渐降低到基础水平;线粒体钙到达峰值(4倍)的时间稍滞后(5~8s),并且回落更慢,300s时至1.5倍。在ATP受体P2X7抑制剂A438079预处理的实验组,上述胞浆钙和线粒体钙浓度上升不明显。结论:构建了能在活体细胞内通过荧光探针实时监测钙离子响应胞外ATP刺激的细胞实验体系,为进一步深入探究ATP等危险信号导致细胞的炎性损伤机制奠定了基础。